• 9 czerwca, 2022

Postępy Cryo-EM w określaniu struktury RNA

Niedawno wykazaliśmy, w jaki sposób kropelki lipidów mogą służyć jako  dane in situ  do korelowania zestawów danych z mikroskopii kriofluorescencyjnej (cryo-FM) i krio-skoncentrowanej mikroskopii elektronowej ze skaningową wiązką jonów (cryo-FIB-SEM) komórek ssaków hodowanych na siatkach. Tutaj opisujemy krok po kroku protokół dla korelacji cryo-FM i krio-FIB-SEM, począwszy od przygotowania próbki linii komórkowej C2C12, a następnie obrazowania za pomocą cryo-FM i krio-FIB-SEM. Na koniec szczegółowo opisujemy, jak wykonać korelację 3D z dokładnością submikronową. Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wykorzystania i wykonania tego profilu, prosimy zapoznać się z Scher et al. (2021).

Receptor związany z sortowaniem z powtórzeniami typu A (SORLA) jest ważnym receptorem regulującym normalne funkcje komórkowe poprzez sortowanie białek.

Tutaj określiliśmy struktury pełnej długości SORLA i zidentyfikowaliśmy dwie różne konformacje apo-SORLA przy użyciu jednocząsteczkowej kriogenicznej mikroskopii elektronowej. W przeciwieństwie do białek homologicznych, zarówno formy monomeryczne, jak i dimeryczne SORLA istniały w roztworze obojętnym.

  • Tylko trzy wiązania wodorowe w pobliżu granicy faz dimeru sugerowały udział w dimeryzacji. Orientacja reszty R490 była kluczowym punktem dla wiązania liganda. Wyniki te sugerują unikalny mechanizm dimeryzacji SORLA w transporcie białek.
  • Mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM) okazała się bezprecedensowym narzędziem do rozpoznawania struktur białkowych w rozdzielczości atomowej. Wglądy strukturalne próbek biologicznych niedostępne w konwencjonalnej krystalografii rentgenowskiej i NMR można badać za pomocą krio-EM, ponieważ pomiary są przeprowadzane w warunkach zbliżonych do natywnych, wolnych od kryształów, a duże kompleksy białkowe o niejednorodności konformacyjnej i składowej są łatwo rozwiązywane.
  • RNA pozostaje niedostatecznie zbadane w krio-EM, pomimo jego zasadniczej roli w różnych procesach biologicznych. W tym przeglądzie podkreślono obecne wyzwania i niedawne postępy w stosowaniu analizy krio-EM pojedynczych cząstek do określania struktur RNA wolnych od białek, co umożliwiło udoskonalenie przygotowywania próbek i integracja wielu metod strukturalnych i biochemicznych.
  • Konserwatywna ATP-aza p97 (Cdc48 u drożdży) i adaptery pośredniczą w różnych procesach komórkowych poprzez rozkładanie poliubikwitynowanych białek i ekstrakcję ich z zespołów makromolekularnych i błon w celu ich dezagregacji i degradacji.
  • Tandemowe domeny ATPazy (D1 i D2) heksameru p97/Cdc48 tworzą ułożone w stos pierścienie. p97/Cdc48 może rozwijać substraty poprzez przewleczenie ich przez centralny por. Pętle porów krytyczne dla rozwinięcia substratu nie są jednak dobrze uporządkowane w konformacjach p97/Cdc48 bez substratu.
  • Nie jest jasne, w jaki sposób p97/Cdc48 organizuje swoje pętle porów pod kątem zaangażowania substratu. Tutaj pokazujemy, że p97/Cdc48 może tworzyć podwójne heksamery (DH) połączone pierścieniem D2. Struktury Cryo-EM p97 DH wykazują konformację kompetentną dla ATPazy z uporządkowanymi pętlami porów.
  • Rozszerzenie C-końcowe (CTE) łączy sąsiednie D2 w każdym heksamerze i rozszerza centralny por pierścienia D2. Mutacje Cdc48 CTE znoszą rozwój substratu. Proponujemy, aby p97/Cdc48 DH wychwytywał stan wzmocniony gotowy do zaangażowania substratu.

 

U bifidobakterii fosfoketolaza (PKT) odgrywa kluczową rolę w centralnej ścieżce fermentacji heksozy zwanej „przeciekiem bifidowym”.

Trójwymiarową strukturę PKT z Bifidobacterium longum z koenzymem difosforanu tiaminy (ThDpp) określono z rozdzielczością 2,1 Å za pomocą analizy pojedynczych cząstek cryo-EM z użyciem 196 147 cząstek w celu zbudowania modelu strukturalnego oktameru PKT powiązanego symetrią D4 . Chociaż struktura krio-EM PKT była prawie identyczna z rentgenowską strukturą krystaliczną wcześniej określoną przy rozdzielczości 2,2 Å, w strukturze krio-EM zaobserwowano kilka interesujących cech strukturalnych.

Ponieważ struktura ta została rozwiązana przy stosunkowo wysokiej rozdzielczości, zaobserwowano, że kilka reszt aminokwasowych przyjmuje wiele konformacji. Wśród nich Q546-D547-H548-N549 (pętla QN) wykazują największą zmianę strukturalną, która wydaje się być związana z enzymatyczną funkcją PKT. Pętla QN znajduje się przy wejściu do kieszeni wiążącej podłoże. Mniejszy konformer pętli QN jest podobny do konformacji pętli QN w strukturze krystalicznej. Główny konformer znajduje się dalej od ThDpp niż mniejszy konformer.

Co ciekawe, główny konformer w strukturze krio-EM PKT przypomina odpowiednią strukturę pętli związanej z substratem transketolazy Escherichia coli. Oznacza to, że mniejszy i główny konformer mogą odpowiadać odpowiednio stanom „zamkniętym” i „otwartym” dla dostępu do substratu. Ponadto, dzięki analizie o wysokiej rozdzielczości, w strukturze krio-EM PKT zaobserwowano wiele cząsteczek wody. Omówiono cechy strukturalne cząsteczek wody w strukturze krio-EM i porównano je z cząsteczkami wody obserwowanymi w strukturze krystalicznej.

Kompleks porów jądrowych (NPC) przenosi ładunek przez otoczkę jądrową. Tutaj przedstawiamy jednocząstkową strukturę krio-EM podjednostki pierścienia jądrowego (NR) z Xenopus laevis NPC przy średniej rozdzielczości 5,6 Å. Podjednostka NR zawiera dwa 10-członowe kompleksy Y, każdy z nukleoporyną ELYS blisko związaną z Nup160 i Nup37 długiego ramienia.

W przeciwieństwie do pierścienia cytoplazmatycznego (CR) lub pierścienia wewnętrznego (IR), podjednostka NR zawiera tylko jedną cząsteczkę Nup205 i Nup93. Nup205 wiąże oba ramiona kompleksów Y i oddziałuje z rdzeniem wewnętrznego kompleksu Y z sąsiedniej podjednostki. Nup93 łączy trzony wewnętrznych i zewnętrznych kompleksów Y w tej samej podjednostce NR i umieszcza swoją wydłużoną helisę na końcu N w osiowym rowku Nup205 z sąsiedniej podjednostki.

CryoSure-DMSO

WAK-DMSO-10 WakChemie 10x10 ml 266.05 EUR

DMSO, anhydrous

90082 Biotium 10ML 73 EUR

Dry DMSO, 14ML

X022-14ML Arbor Assays 14ML 143 EUR

Dry DMSO, 20ML

X022-20ML Arbor Assays 20ML 194 EUR

Dry DMSO, 2ML

X022-2ML Arbor Assays 2ML 94 EUR

Dry DMSO, 4ML

X022-4ML Arbor Assays 4ML 116 EUR

Dry DMSO, 5ML

X022-5ML Arbor Assays 5ML 122 EUR

Trametinib (DMSO solvate)

HY-10999A MedChemExpress 100mg 214 EUR

Dimethyl sulfoxide (DMSO)

D0231 Bio Basic 500ml 73.79 EUR

Trametinib DMSO solvate

A3887-10 ApexBio 10 mg 108 EUR

Trametinib DMSO solvate

A3887-100 ApexBio 100 mg 187 EUR

Trametinib DMSO solvate

A3887-5.1 ApexBio 10 mM (in 1mL DMSO) 113 EUR

Trametinib DMSO solvate

A3887-50 ApexBio 50 mg 142 EUR

EvaGreen, 2000X in DMSO

31019 Biotium 50uL 245 EUR

DMAO, 2mM in DMSO

40012 Biotium 1ML 296 EUR

RedDot 2, 200X in DMSO

40061 Biotium 250uL 362 EUR

RedDot 2, 200X in DMSO

40061-1 Biotium 1mL 561 EUR

RedDot 2, 200X in DMSO

40061-T Biotium 25uL 131 EUR

Thiazole Orange, 10mM in DMSO

40077 Biotium 1mL 145 EUR

NucSpot 470, 1000X in DMSO

40083 Biotium 200uL 372 EUR

NucSpot 470, 1000X in DMSO

40083-T Biotium 20uL 106 EUR

Thiazole Red, 1mM in DMSO

40087 Biotium 1mL 320 EUR

Oxazole Yellow, 1mM in DMSO

40089 Biotium 1mL 336 EUR

LysoView 540, 1000X in DMSO

70061 Biotium 50uL 205 EUR

LysoView 540, 1000X in DMSO

70061-T Biotium 10uL 94 EUR

LysoViewâ„¢ 405, 1000X in DMSO

70066 Biotium 50uL 201 EUR

LysoViewâ„¢ 488, 1000X in DMSO

70067 Biotium 50uL 201 EUR

MitoViewâ„¢ 720, 1000X in DMSO

70068 Biotium 20X50UG 255 EUR

250 ML DMSO (DIMETHYL SULFOXIDE)

25-950-CQC CORNING 250 mL/pk 94 EUR

DMSO, labeling grade, 1 mL

15050 Lumiprobe 1 mL 37 EUR

Thiazole orange *10 mM in DMSO*

17519 AAT Bioquest 10 mL 115 EUR

EGTA AM *10 mM DMSO solution*

21006 AAT Bioquest 1 mL 176 EUR

Ethidium homodimer I, 2mM DMSO solution

40014 Biotium 0.5ML 257 EUR

Ethidium homodimer III, 1mM in DMSO

40051 Biotium 200uL 312 EUR

Thiazole Red Homodimer, 1mM in DMSO

40080 Biotium 200uL 355 EUR

NucSpot Live 488, 1000X in DMSO

40081 Biotium 50uL 355 EUR

NucSpot Live 488, 1000X in DMSO

40081-T Biotium 10uL 116 EUR

NucSpot Far-Red, 1000X in DMSO

40085 Biotium 0.5mL 563 EUR

NucSpot Far-Red, 1000X in DMSO

40085-T Biotium 50uL 131 EUR

Thiazole Green, 10, 000X in DMSO

40086-0.5mL Biotium 0.5mL 188 EUR

Thiazole Green, 10, 000X in DMSO

40086-1mL Biotium 1mL 287 EUR

TMRE, 2 mM solution in DMSO

70005 Biotium 0.5ML 149 EUR

Calcein AM, 4mm in anhydrous DMSO

80011-1 Biotium 100uL 226 EUR

6-TAMRA, SE in DMSO:100uL

90097 Biotium 100uL 307 EUR

6-Rox, SE in DMSO:(100uL)

90098 Biotium 100uL 307 EUR

Cycloheximide Solution (10% in DMSO Sterile)

C084-10x1ML TOKU-E 10x1 mL 194 EUR

Cycloheximide Solution (10% in DMSO Sterile)

C084-1ML TOKU-E 1 mL 54 EUR

Phosphatase Inhibitor Cocktail I (100X in DMSO)

HY-K0021 MedChemExpress 1 mL × 10 412 EUR

Phosphatase Inhibitor Cocktail III (100X in DMSO)

HY-K0023 MedChemExpress 1 mL × 50 2162 EUR

Deacetylase Inhibitor Cocktail (100× in 70% DMSO)

HY-K0030 MedChemExpress 1 mL × 10 279 EUR

Thiazole Orange Homodimer, 1 mM in DMSO

40079 Biotium 200uL 439 EUR

TO iodide (515/531), 1mM in DMSO

40088 Biotium 1mL 303 EUR

Pluronic f-127 20% solution in DMSO

59004 Biotium 1ML 66 EUR

LysoViewâ„¢ 405, 1000X in DMSO, Trial Size

70066-T Biotium 10uL 93 EUR

LysoViewâ„¢ 488, 1000X in DMSO, Trial Size

70067-T Biotium 10uL 93 EUR

MitoViewâ„¢ 720, 1000X in DMSO, Trial Size

70068-T Biotium 50UG 104 EUR

Calcein AM, 1mg/ml in anhydrous DMSO

80011-2 Biotium 1ML 231 EUR

Phosphatase Inhibitor Cocktail 1 (100X in DMSO)

K1012-1 ApexBio 1 ml 102 EUR

Phosphatase Inhibitor Cocktail 1 (100X in DMSO)

K1012-50 ApexBio 50x1 ml 1592 EUR

Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 (100X in DMSO)

K1014-1 ApexBio 1 ml 113 EUR

Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 (100X in DMSO)

K1014-50 ApexBio 50x1 ml 2184 EUR

Deacetylase Inhibitor Cocktail (100× in 70% DMSO)

K1017-1 ApexBio 1 ml 87 EUR

Deacetylase Inhibitor Cocktail (100× in 70% DMSO)

K1017-50 ApexBio 50x1 ml 792 EUR

Cyanine5.5 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO

34030 Lumiprobe 500 µl 182 EUR

Cyanine7 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO

35030 Lumiprobe 500 µl 182 EUR

Cyanine7.5 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO

36030 Lumiprobe 500 µl 182 EUR

Cyanine3 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO

41030 Lumiprobe 10 mM/DMSO 316 EUR

Cyanine3.5 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO

42030 Lumiprobe 1 ml 316 EUR

Cyanine5 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO

43030 Lumiprobe 1 ml 316 EUR

Cyanine5.5 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO

44030 Lumiprobe 1 ml 316 EUR

Cyanine7 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO

45030 Lumiprobe 1 mL 316 EUR

Cyanine3 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO

11030 Lumiprobe 10 mM/DMSO 108 EUR

Cyanine3.5 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO

12030 Lumiprobe 100 µl 108 EUR

Cyanine5 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO

13030 Lumiprobe 100 µl 108 EUR

Cyanine5.5 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO

14030 Lumiprobe 100 µl 108 EUR

Cyanine7 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO

15030 Lumiprobe 100 µl 108 EUR

Cyanine7.5 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO

16030 Lumiprobe 100 µl 108 EUR

Cyanine3 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO

31030 Lumiprobe 10 mM/DMSO 182 EUR

Cyanine3.5 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO

32030 Lumiprobe 500 µl 182 EUR

Cyanine5 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO

33030 Lumiprobe 500 µl 182 EUR

EZBlock? Protease Inhibitor Cocktail VIII, DMSO-Free

K395-1 Biovision 126 EUR

EZBlock? Protease Inhibitor Cocktail VIII, DMSO-Free

K395-set Biovision 392 EUR

Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 100X in DMSO)

HY-K0010 MedChemExpress 1 mL × 100 1772 EUR

Fluo-3, AM ester, 1mm in anhydrous DMSO

50015 Biotium 1ML 259 EUR

Fura-2, AM ester, 1mm in anhydrous DMSO

50029 Biotium 1ML 222 EUR

BCECF, AM ester 1mg/ml in dry DMSO

51009 Biotium 1ML 155 EUR

NucView 488 Caspase-3 Substrate, 1mM in DMSO

10402 Biotium 100uL 396 EUR

NucView 488 Caspase-3 Substrate, 1mM in DMSO

10402-T Biotium 10uL 120 EUR

Protease Inhibitor Cocktail(EDTA-Free,100X in DMSO)

K1007-1 ApexBio 1 ml 81 EUR

Protease Inhibitor Cocktail(EDTA-Free,100X in DMSO)

K1007-20 ApexBio 20x1 ml 514 EUR

Protease Inhibitor Cocktail(EDTA-Free,100X in DMSO)

K1007-50 ApexBio 50x1 ml 1094 EUR

Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 200X in DMSO)

K1008-1 ApexBio 1 ml 81 EUR

Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 200X in DMSO)

K1008-20 ApexBio 20x1 ml 514 EUR

Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 200X in DMSO)

K1008-50 ApexBio 50x1 ml 1094 EUR

Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 100X in DMSO)

K1009-1 ApexBio 1 ml 90 EUR

Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 100X in DMSO)

K1009-50 ApexBio 50x1 ml 1210 EUR

Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 100X in DMSO)

K1010-1 ApexBio 1 ml 90 EUR

Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 100X in DMSO)

K1010-50 ApexBio 50x1 ml 1210 EUR

Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 100X in DMSO)

K1011-1 ApexBio 1 ml 90 EUR

Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 100X in DMSO)

K1011-50 ApexBio 50x1 ml 1210 EUR

Wraz z innymi informacjami strukturalnymi wygenerowaliśmy złożony model atomowy rusztowania pierścienia centralnego, który obejmuje NR, IR i CR. IR jest połączony z dwoma zewnętrznymi pierścieniami głównie przez Nup155. Model ten ułatwia funkcjonalne zrozumienie NPC kręgowców.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.