Postępy Cryo-EM w określaniu struktury RNA
Ewa
- 0
Niedawno wykazaliśmy, w jaki sposób kropelki lipidów mogą służyć jako dane in situ do korelowania zestawów danych z mikroskopii kriofluorescencyjnej (cryo-FM) i krio-skoncentrowanej mikroskopii elektronowej ze skaningową wiązką jonów (cryo-FIB-SEM) komórek ssaków hodowanych na siatkach. Tutaj opisujemy krok po kroku protokół dla korelacji cryo-FM i krio-FIB-SEM, począwszy od przygotowania próbki linii komórkowej C2C12, a następnie obrazowania za pomocą cryo-FM i krio-FIB-SEM. Na koniec szczegółowo opisujemy, jak wykonać korelację 3D z dokładnością submikronową. Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wykorzystania i wykonania tego profilu, prosimy zapoznać się z Scher et al. (2021).
Receptor związany z sortowaniem z powtórzeniami typu A (SORLA) jest ważnym receptorem regulującym normalne funkcje komórkowe poprzez sortowanie białek.
Tutaj określiliśmy struktury pełnej długości SORLA i zidentyfikowaliśmy dwie różne konformacje apo-SORLA przy użyciu jednocząsteczkowej kriogenicznej mikroskopii elektronowej. W przeciwieństwie do białek homologicznych, zarówno formy monomeryczne, jak i dimeryczne SORLA istniały w roztworze obojętnym.
- Tylko trzy wiązania wodorowe w pobliżu granicy faz dimeru sugerowały udział w dimeryzacji. Orientacja reszty R490 była kluczowym punktem dla wiązania liganda. Wyniki te sugerują unikalny mechanizm dimeryzacji SORLA w transporcie białek.
- Mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM) okazała się bezprecedensowym narzędziem do rozpoznawania struktur białkowych w rozdzielczości atomowej. Wglądy strukturalne próbek biologicznych niedostępne w konwencjonalnej krystalografii rentgenowskiej i NMR można badać za pomocą krio-EM, ponieważ pomiary są przeprowadzane w warunkach zbliżonych do natywnych, wolnych od kryształów, a duże kompleksy białkowe o niejednorodności konformacyjnej i składowej są łatwo rozwiązywane.
- RNA pozostaje niedostatecznie zbadane w krio-EM, pomimo jego zasadniczej roli w różnych procesach biologicznych. W tym przeglądzie podkreślono obecne wyzwania i niedawne postępy w stosowaniu analizy krio-EM pojedynczych cząstek do określania struktur RNA wolnych od białek, co umożliwiło udoskonalenie przygotowywania próbek i integracja wielu metod strukturalnych i biochemicznych.
- Konserwatywna ATP-aza p97 (Cdc48 u drożdży) i adaptery pośredniczą w różnych procesach komórkowych poprzez rozkładanie poliubikwitynowanych białek i ekstrakcję ich z zespołów makromolekularnych i błon w celu ich dezagregacji i degradacji.
- Tandemowe domeny ATPazy (D1 i D2) heksameru p97/Cdc48 tworzą ułożone w stos pierścienie. p97/Cdc48 może rozwijać substraty poprzez przewleczenie ich przez centralny por. Pętle porów krytyczne dla rozwinięcia substratu nie są jednak dobrze uporządkowane w konformacjach p97/Cdc48 bez substratu.
- Nie jest jasne, w jaki sposób p97/Cdc48 organizuje swoje pętle porów pod kątem zaangażowania substratu. Tutaj pokazujemy, że p97/Cdc48 może tworzyć podwójne heksamery (DH) połączone pierścieniem D2. Struktury Cryo-EM p97 DH wykazują konformację kompetentną dla ATPazy z uporządkowanymi pętlami porów.
- Rozszerzenie C-końcowe (CTE) łączy sąsiednie D2 w każdym heksamerze i rozszerza centralny por pierścienia D2. Mutacje Cdc48 CTE znoszą rozwój substratu. Proponujemy, aby p97/Cdc48 DH wychwytywał stan wzmocniony gotowy do zaangażowania substratu.
U bifidobakterii fosfoketolaza (PKT) odgrywa kluczową rolę w centralnej ścieżce fermentacji heksozy zwanej „przeciekiem bifidowym”.
Trójwymiarową strukturę PKT z Bifidobacterium longum z koenzymem difosforanu tiaminy (ThDpp) określono z rozdzielczością 2,1 Å za pomocą analizy pojedynczych cząstek cryo-EM z użyciem 196 147 cząstek w celu zbudowania modelu strukturalnego oktameru PKT powiązanego symetrią D4 . Chociaż struktura krio-EM PKT była prawie identyczna z rentgenowską strukturą krystaliczną wcześniej określoną przy rozdzielczości 2,2 Å, w strukturze krio-EM zaobserwowano kilka interesujących cech strukturalnych.
Ponieważ struktura ta została rozwiązana przy stosunkowo wysokiej rozdzielczości, zaobserwowano, że kilka reszt aminokwasowych przyjmuje wiele konformacji. Wśród nich Q546-D547-H548-N549 (pętla QN) wykazują największą zmianę strukturalną, która wydaje się być związana z enzymatyczną funkcją PKT. Pętla QN znajduje się przy wejściu do kieszeni wiążącej podłoże. Mniejszy konformer pętli QN jest podobny do konformacji pętli QN w strukturze krystalicznej. Główny konformer znajduje się dalej od ThDpp niż mniejszy konformer.
Co ciekawe, główny konformer w strukturze krio-EM PKT przypomina odpowiednią strukturę pętli związanej z substratem transketolazy Escherichia coli. Oznacza to, że mniejszy i główny konformer mogą odpowiadać odpowiednio stanom „zamkniętym” i „otwartym” dla dostępu do substratu. Ponadto, dzięki analizie o wysokiej rozdzielczości, w strukturze krio-EM PKT zaobserwowano wiele cząsteczek wody. Omówiono cechy strukturalne cząsteczek wody w strukturze krio-EM i porównano je z cząsteczkami wody obserwowanymi w strukturze krystalicznej.
Kompleks porów jądrowych (NPC) przenosi ładunek przez otoczkę jądrową. Tutaj przedstawiamy jednocząstkową strukturę krio-EM podjednostki pierścienia jądrowego (NR) z Xenopus laevis NPC przy średniej rozdzielczości 5,6 Å. Podjednostka NR zawiera dwa 10-członowe kompleksy Y, każdy z nukleoporyną ELYS blisko związaną z Nup160 i Nup37 długiego ramienia.
W przeciwieństwie do pierścienia cytoplazmatycznego (CR) lub pierścienia wewnętrznego (IR), podjednostka NR zawiera tylko jedną cząsteczkę Nup205 i Nup93. Nup205 wiąże oba ramiona kompleksów Y i oddziałuje z rdzeniem wewnętrznego kompleksu Y z sąsiedniej podjednostki. Nup93 łączy trzony wewnętrznych i zewnętrznych kompleksów Y w tej samej podjednostce NR i umieszcza swoją wydłużoną helisę na końcu N w osiowym rowku Nup205 z sąsiedniej podjednostki.
CryoSure-DMSO |
|||
WAK-DMSO-10 | WakChemie | 10x10 ml | 319.26 EUR |
DMSO, anhydrous |
|||
90082 | Biotium | 10ML | 87.6 EUR |
Dry DMSO, 2ML |
|||
X022-2ML | Arbor Assays | 2ML | 37 EUR |
Dry DMSO, 4ML |
|||
X022-4ML | Arbor Assays | 4ML | 54 EUR |
Dry DMSO, 5ML |
|||
X022-5ML | Arbor Assays | 5ML | 59 EUR |
Dry DMSO, 14ML |
|||
X022-14ML | Arbor Assays | 14ML | 109 EUR |
Dry DMSO, 20ML |
|||
X022-20ML | Arbor Assays | 20ML | 168 EUR |
Trametinib DMSO solvate |
|||
A3887-10 | ApexBio | 10 mg | 129.6 EUR |
Trametinib DMSO solvate |
|||
A3887-100 | ApexBio | 100 mg | 224.4 EUR |
Trametinib DMSO solvate |
|||
A3887-5.1 | ApexBio | 10 mM (in 1mL DMSO) | 135.6 EUR |
Trametinib DMSO solvate |
|||
A3887-50 | ApexBio | 50 mg | 170.4 EUR |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) |
|||
D0231 | Bio Basic | 500ml | 88.55 EUR |
Trametinib (DMSO solvate) |
|||
HY-10999A | MedChemExpress | 100mg | 256.8 EUR |
EvaGreen, 2000X in DMSO |
|||
31019 | Biotium | 50uL | 294 EUR |
6-Rox, SE in DMSO:(100uL) |
|||
90098 | Biotium | 100uL | 368.4 EUR |
6-TAMRA, SE in DMSO:100uL |
|||
90097 | Biotium | 100uL | 368.4 EUR |
RedDot 2, 200X in DMSO |
|||
40061 | Biotium | 250uL | 434.4 EUR |
RedDot 2, 200X in DMSO |
|||
40061-1 | Biotium | 1mL | 673.2 EUR |
RedDot 2, 200X in DMSO |
|||
40061-T | Biotium | 25uL | 157.2 EUR |
250mL DMSO Dimethyl Sulfoxide |
|||
25-950-CQC | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 114 EUR |
NucSpot 470, 1000X in DMSO |
|||
40083-T | Biotium | 20uL | 127.2 EUR |
LysoView 540, 1000X in DMSO |
|||
70061 | Biotium | 50uL | 246 EUR |
LysoView 540, 1000X in DMSO |
|||
70061-T | Biotium | 10uL | 112.8 EUR |
LysoViewâ„¢ 405, 1000X in DMSO |
|||
70066 | Biotium | 50uL | 241.2 EUR |
LysoViewâ„¢ 488, 1000X in DMSO |
|||
70067 | Biotium | 50uL | 241.2 EUR |
MitoViewâ„¢ 720, 1000X in DMSO |
|||
70068 | Biotium | 20X50UG | 306 EUR |
DMSO, labeling grade, 1 mL |
|||
15050 | Lumiprobe | 1 mL | 44.4 EUR |
DMSO Resistant Peel Seal Roll |
|||
PCR0852 | Scientific Laboratory Supplies | 1ROLL | 1563.6 EUR |
DMSO Resistant Peel Seal Roll |
|||
PCR0854 | Scientific Laboratory Supplies | 1ROLL | 1717.2 EUR |
DMSO Resistant Peel Seal Roll |
|||
PCR0856 | Scientific Laboratory Supplies | 1ROLL | 53.01 EUR |
DMSO Resistant Peel Seal Roll |
|||
PCR0858 | Scientific Laboratory Supplies | 1ROLL | 397.2 EUR |
DMSO Resistant Peel Seal Roll |
|||
PCR0860 | Scientific Laboratory Supplies | 1ROLL | 1756.8 EUR |
DMSO Resistant Peel Seal Roll |
|||
PCR0862 | Scientific Laboratory Supplies | 1ROLL | 1928.4 EUR |
DMSO Resistant Peel Seal Roll |
|||
PCR0864 | Scientific Laboratory Supplies | 1ROLL | 51.44 EUR |
LAMP Greenâ„¢ *50X DMSO Solution* |
|||
17555-100ul | AAT Bioquest | 100 ul | 301 EUR |
Q4everâ„¢ Green *1250X DMSO Solution* |
|||
17608-100ul | AAT Bioquest | 100 ul | 151 EUR |
Q4everâ„¢ Green *1250X DMSO Solution* |
|||
17609-2ml | AAT Bioquest | 2 ml | 2029 EUR |
Peelbl DMSO Resistant AdhFoil sh |
|||
PCR0542 | Scientific Laboratory Supplies | PK100 | 331.2 EUR |
EGTA AM *10 mM DMSO solution* |
|||
21006 | AAT Bioquest | 1 mL | 166 EUR |
NucSpot Live 488, 1000X in DMSO |
|||
40081-T | Biotium | 10uL | 139.2 EUR |
TMRE, 2 mM solution in DMSO |
|||
70005 | Biotium | 0.5ML | 178.8 EUR |
EGTA AM *10 mM DMSO solution* |
|||
21006-1mL | AAT Bioquest | 1 mL | 166 EUR |
Cyanine7 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO |
|||
15030 | Lumiprobe | 100 µl | 129.6 EUR |
Cyanine7.5 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO |
|||
16030 | Lumiprobe | 100 µl | 129.6 EUR |
Cyanine3.5 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO |
|||
12030 | Lumiprobe | 100 µl | 129.6 EUR |
Cyanine5 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO |
|||
13030 | Lumiprobe | 100 µl | 129.6 EUR |
Cyanine3 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO |
|||
11030 | Lumiprobe | 10 mM/DMSO | 129.6 EUR |
Cyanine5.5 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO |
|||
34030 | Lumiprobe | 500 µl | 218.4 EUR |
Cyanine7 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO |
|||
35030 | Lumiprobe | 500 µl | 218.4 EUR |
Cyanine7.5 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO |
|||
36030 | Lumiprobe | 500 µl | 218.4 EUR |
Cyanine5 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO |
|||
33030 | Lumiprobe | 500 µl | 218.4 EUR |
Cyanine3.5 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO |
|||
32030 | Lumiprobe | 500 µl | 218.4 EUR |
Thiazole orange *10 mM in DMSO* |
|||
17519 | AAT Bioquest | 10 mL | 86 EUR |
CYTO-13 *5 mM DMSO solution* |
|||
17553 | AAT Bioquest | 0.5 mL | 222 EUR |
NucSpot Far-Red, 1000X in DMSO |
|||
40085-T | Biotium | 50uL | 157.2 EUR |
Thiazole Green, 10, 000X in DMSO |
|||
40086-0.5mL | Biotium | 0.5mL | 225.6 EUR |
Thiazole Green, 10, 000X in DMSO |
|||
40086-1mL | Biotium | 1mL | 344.4 EUR |
Thiazole orange *10 mM in DMSO* |
|||
17519-10mL | AAT Bioquest | 10 mL | 86 EUR |
CYTO-13 *5 mM DMSO solution* |
|||
17553-05mL | AAT Bioquest | 0.5 mL | 222 EUR |
250 ug/mL Nitromethane in DMSO |
|||
USP-S2722-DMSO | Scientific Laboratory Supplies | 1ML | 109.2 EUR |
LAMP Green® *50X DMSO Solution* |
|||
17555 | AAT Bioquest | 100 ul | 301 EUR |
DMSO Resistant Peel Seal 100 She |
|||
PCR0866 | Scientific Laboratory Supplies | PK100 | 145.2 EUR |
Calcein AM, 4mm in anhydrous DMSO |
|||
80011-1 | Biotium | 100uL | 271.2 EUR |
Q4ever™ Green *1250X DMSO Solution* |
|||
17608 | AAT Bioquest | 100 ul | 151 EUR |
Q4ever™ Green *1250X DMSO Solution* |
|||
17609 | AAT Bioquest | 2 ml | 2029 EUR |
3600 ug/mL Tetrahyrdofuran in DMSO |
|||
USP-S3460-DMSO | Scientific Laboratory Supplies | 1ML | 109.2 EUR |
Cyanine5.5 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO |
|||
44030 | Lumiprobe | 1 ml | 379.2 EUR |
Cyanine3.5 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO |
|||
42030 | Lumiprobe | 1 ml | 379.2 EUR |
Cyanine5 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO |
|||
43030 | Lumiprobe | 1 ml | 379.2 EUR |
Cyanine3 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO |
|||
41030 | Lumiprobe | 10 mM/DMSO | 379.2 EUR |
3100 ug/mL Ethylene Glycol in DMSO |
|||
USP-S1952-DMSO | Scientific Laboratory Supplies | 1ML | 109.2 EUR |
MycoLightâ„¢ Red JJ94 *2.5 mM in DMSO* |
|||
24006-100uL | AAT Bioquest | 100 uL | 334 EUR |
Deacetylase Inhibitor Cocktail (100× in 70% DMSO) |
|||
K1017-1 | ApexBio | 1 ml | 104.4 EUR |
Deacetylase Inhibitor Cocktail (100× in 70% DMSO) |
|||
K1017-10 | ApexBio | 10x1 ml | 282 EUR |
Deacetylase Inhibitor Cocktail (100× in 70% DMSO) |
|||
K1017-100 | ApexBio | 100x1 ml | 1395.6 EUR |
Deacetylase Inhibitor Cocktail (100× in 70% DMSO) |
|||
K1017-50 | ApexBio | 50x1 ml | 950.4 EUR |
Deacetylase Inhibitor Cocktail (100× in 70% DMSO) |
|||
HY-K0030 | MedChemExpress | 1 mL × 10 | 334.8 EUR |
Calcein AM, 1mg/ml in anhydrous DMSO |
|||
80011-2 | Biotium | 1ML | 277.2 EUR |
LysoViewâ„¢ 405, 1000X in DMSO, Trial Size |
|||
70066-T | Biotium | 10uL | 111.6 EUR |
LysoViewâ„¢ 488, 1000X in DMSO, Trial Size |
|||
70067-T | Biotium | 10uL | 111.6 EUR |
MitoViewâ„¢ 720, 1000X in DMSO, Trial Size |
|||
70068-T | Biotium | 50UG | 124.8 EUR |
MycoLightâ„¢ Green JJ98 *5 mM in DMSO* |
|||
24000-100uL | AAT Bioquest | 100 uL | 222 EUR |
MycoLightâ„¢ Green JJ99 *5 mM in DMSO* |
|||
24001-100ul | AAT Bioquest | 100 ul | 222 EUR |
Cycloheximide Solution (10% in DMSO Sterile) |
|||
C084-10x1ML | TOKU-E | 10x1 mL | 232.8 EUR |
Cycloheximide Solution (10% in DMSO Sterile) |
|||
C084-1ML | TOKU-E | 1 mL | 64.8 EUR |
ROX azide, 5- isomer, 100 uL, 10 mM/DMSO |
|||
11230 | Lumiprobe | 100 µl | 129.6 EUR |
ROX azide, 5- isomer, 500 uL, 10 mM/DMSO |
|||
31230 | Lumiprobe | 500 µl | 218.4 EUR |
Pluronic f-127 20% solution in DMSO |
|||
59004 | Biotium | 1ML | 79.2 EUR |
1900 ug/mL 1 4-Dioxane in DMSO |
|||
USP-S1715-DMSO | Scientific Laboratory Supplies | 1ML | 109.2 EUR |
FAM azide, 5-isomer, 100 uL, 10 mM/DMSO |
|||
14130 | Lumiprobe | 100 ul | 90 EUR |
R6G azide, 5-isomer, 100 uL, 10 mM/DMSO |
|||
14430 | Lumiprobe | 100 µl | 129.6 EUR |
FAM azide, 6-isomer, 100 uL, 10 mM/DMSO |
|||
15130 | Lumiprobe | 100 ul | 90 EUR |
FAM azide, 5-isomer, 500 uL, 10 mM/DMSO |
|||
34130 | Lumiprobe | 500 ul | 103.2 EUR |
FAM azide, 6-isomer, 500 uL, 10 mM/DMSO |
|||
35130 | Lumiprobe | 500 ul | 103.2 EUR |
R6G azide, 5-isomer, 500 uL, 10 mM/DMSO |
|||
34430 | Lumiprobe | 500 µl | 218.4 EUR |
Nuclear Redâ„¢ LCS1 *5 mM DMSO Solution* |
|||
17542-05ml | AAT Bioquest | 0.5 ml | 109 EUR |
Nuclear Redâ„¢ LCS2 *5 mM DMSO Solution* |
|||
17545-05ml | AAT Bioquest | 0.5 ml | 109 EUR |
Nuclear Redâ„¢ DCS1 *5 mM DMSO Solution* |
|||
17552-05ml | AAT Bioquest | 0.5 ml | 109 EUR |
BCECF, AM ester 1mg/ml in dry DMSO |
|||
51009 | Biotium | 1ML | 186 EUR |
50000 ug/mL 111-Trichloroethane in DMSO |
|||
USP-S3605-DMSO | Scientific Laboratory Supplies | 1ML | 109.2 EUR |
Wraz z innymi informacjami strukturalnymi wygenerowaliśmy złożony model atomowy rusztowania pierścienia centralnego, który obejmuje NR, IR i CR. IR jest połączony z dwoma zewnętrznymi pierścieniami głównie przez Nup155. Model ten ułatwia funkcjonalne zrozumienie NPC kręgowców.