• 9 czerwca, 2022

Postępy Cryo-EM w określaniu struktury RNA

Niedawno wykazaliśmy, w jaki sposób kropelki lipidów mogą służyć jako  dane in situ  do korelowania zestawów danych z mikroskopii kriofluorescencyjnej (cryo-FM) i krio-skoncentrowanej mikroskopii elektronowej ze skaningową wiązką jonów (cryo-FIB-SEM) komórek ssaków hodowanych na siatkach. Tutaj opisujemy krok po kroku protokół dla korelacji cryo-FM i krio-FIB-SEM, począwszy od przygotowania próbki linii komórkowej C2C12, a następnie obrazowania za pomocą cryo-FM i krio-FIB-SEM. Na koniec szczegółowo opisujemy, jak wykonać korelację 3D z dokładnością submikronową. Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wykorzystania i wykonania tego profilu, prosimy zapoznać się z Scher et al. (2021).

Receptor związany z sortowaniem z powtórzeniami typu A (SORLA) jest ważnym receptorem regulującym normalne funkcje komórkowe poprzez sortowanie białek.

Tutaj określiliśmy struktury pełnej długości SORLA i zidentyfikowaliśmy dwie różne konformacje apo-SORLA przy użyciu jednocząsteczkowej kriogenicznej mikroskopii elektronowej. W przeciwieństwie do białek homologicznych, zarówno formy monomeryczne, jak i dimeryczne SORLA istniały w roztworze obojętnym.

  • Tylko trzy wiązania wodorowe w pobliżu granicy faz dimeru sugerowały udział w dimeryzacji. Orientacja reszty R490 była kluczowym punktem dla wiązania liganda. Wyniki te sugerują unikalny mechanizm dimeryzacji SORLA w transporcie białek.
  • Mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM) okazała się bezprecedensowym narzędziem do rozpoznawania struktur białkowych w rozdzielczości atomowej. Wglądy strukturalne próbek biologicznych niedostępne w konwencjonalnej krystalografii rentgenowskiej i NMR można badać za pomocą krio-EM, ponieważ pomiary są przeprowadzane w warunkach zbliżonych do natywnych, wolnych od kryształów, a duże kompleksy białkowe o niejednorodności konformacyjnej i składowej są łatwo rozwiązywane.
  • RNA pozostaje niedostatecznie zbadane w krio-EM, pomimo jego zasadniczej roli w różnych procesach biologicznych. W tym przeglądzie podkreślono obecne wyzwania i niedawne postępy w stosowaniu analizy krio-EM pojedynczych cząstek do określania struktur RNA wolnych od białek, co umożliwiło udoskonalenie przygotowywania próbek i integracja wielu metod strukturalnych i biochemicznych.
  • Konserwatywna ATP-aza p97 (Cdc48 u drożdży) i adaptery pośredniczą w różnych procesach komórkowych poprzez rozkładanie poliubikwitynowanych białek i ekstrakcję ich z zespołów makromolekularnych i błon w celu ich dezagregacji i degradacji.
  • Tandemowe domeny ATPazy (D1 i D2) heksameru p97/Cdc48 tworzą ułożone w stos pierścienie. p97/Cdc48 może rozwijać substraty poprzez przewleczenie ich przez centralny por. Pętle porów krytyczne dla rozwinięcia substratu nie są jednak dobrze uporządkowane w konformacjach p97/Cdc48 bez substratu.
  • Nie jest jasne, w jaki sposób p97/Cdc48 organizuje swoje pętle porów pod kątem zaangażowania substratu. Tutaj pokazujemy, że p97/Cdc48 może tworzyć podwójne heksamery (DH) połączone pierścieniem D2. Struktury Cryo-EM p97 DH wykazują konformację kompetentną dla ATPazy z uporządkowanymi pętlami porów.
  • Rozszerzenie C-końcowe (CTE) łączy sąsiednie D2 w każdym heksamerze i rozszerza centralny por pierścienia D2. Mutacje Cdc48 CTE znoszą rozwój substratu. Proponujemy, aby p97/Cdc48 DH wychwytywał stan wzmocniony gotowy do zaangażowania substratu.

 

U bifidobakterii fosfoketolaza (PKT) odgrywa kluczową rolę w centralnej ścieżce fermentacji heksozy zwanej „przeciekiem bifidowym”.

Trójwymiarową strukturę PKT z Bifidobacterium longum z koenzymem difosforanu tiaminy (ThDpp) określono z rozdzielczością 2,1 Å za pomocą analizy pojedynczych cząstek cryo-EM z użyciem 196 147 cząstek w celu zbudowania modelu strukturalnego oktameru PKT powiązanego symetrią D4 . Chociaż struktura krio-EM PKT była prawie identyczna z rentgenowską strukturą krystaliczną wcześniej określoną przy rozdzielczości 2,2 Å, w strukturze krio-EM zaobserwowano kilka interesujących cech strukturalnych.

Ponieważ struktura ta została rozwiązana przy stosunkowo wysokiej rozdzielczości, zaobserwowano, że kilka reszt aminokwasowych przyjmuje wiele konformacji. Wśród nich Q546-D547-H548-N549 (pętla QN) wykazują największą zmianę strukturalną, która wydaje się być związana z enzymatyczną funkcją PKT. Pętla QN znajduje się przy wejściu do kieszeni wiążącej podłoże. Mniejszy konformer pętli QN jest podobny do konformacji pętli QN w strukturze krystalicznej. Główny konformer znajduje się dalej od ThDpp niż mniejszy konformer.

Co ciekawe, główny konformer w strukturze krio-EM PKT przypomina odpowiednią strukturę pętli związanej z substratem transketolazy Escherichia coli. Oznacza to, że mniejszy i główny konformer mogą odpowiadać odpowiednio stanom „zamkniętym” i „otwartym” dla dostępu do substratu. Ponadto, dzięki analizie o wysokiej rozdzielczości, w strukturze krio-EM PKT zaobserwowano wiele cząsteczek wody. Omówiono cechy strukturalne cząsteczek wody w strukturze krio-EM i porównano je z cząsteczkami wody obserwowanymi w strukturze krystalicznej.

Kompleks porów jądrowych (NPC) przenosi ładunek przez otoczkę jądrową. Tutaj przedstawiamy jednocząstkową strukturę krio-EM podjednostki pierścienia jądrowego (NR) z Xenopus laevis NPC przy średniej rozdzielczości 5,6 Å. Podjednostka NR zawiera dwa 10-członowe kompleksy Y, każdy z nukleoporyną ELYS blisko związaną z Nup160 i Nup37 długiego ramienia.

W przeciwieństwie do pierścienia cytoplazmatycznego (CR) lub pierścienia wewnętrznego (IR), podjednostka NR zawiera tylko jedną cząsteczkę Nup205 i Nup93. Nup205 wiąże oba ramiona kompleksów Y i oddziałuje z rdzeniem wewnętrznego kompleksu Y z sąsiedniej podjednostki. Nup93 łączy trzony wewnętrznych i zewnętrznych kompleksów Y w tej samej podjednostce NR i umieszcza swoją wydłużoną helisę na końcu N w osiowym rowku Nup205 z sąsiedniej podjednostki.

CryoSure-DMSO

WAK-DMSO-10 WakChemie 10x10 ml 319.26 EUR

250 ug/mL Nitromethane in DMSO

USP-S2722-DMSO Scientific Laboratory Supplies 1ML 98.04 EUR

3600 ug/mL Tetrahyrdofuran in DMSO

USP-S3460-DMSO Scientific Laboratory Supplies 1ML 98.04 EUR

3100 ug/mL Ethylene Glycol in DMSO

USP-S1952-DMSO Scientific Laboratory Supplies 1ML 98.04 EUR

50000 ug/mL 111-Trichloroethane in DMSO

USP-S3605-DMSO Scientific Laboratory Supplies 1ML 98.04 EUR

1900 ug/mL 1 4-Dioxane in DMSO

USP-S1715-DMSO Scientific Laboratory Supplies 1ML 98.04 EUR

DMSO, anhydrous

90082 Biotium 10ML 87.6 EUR

Trametinib DMSO solvate

A3887-10 ApexBio 10 mg 129.6 EUR

Trametinib DMSO solvate

A3887-100 ApexBio 100 mg 224.4 EUR

Trametinib DMSO solvate

A3887-5.1 ApexBio 10 mM (in 1mL DMSO) 135.6 EUR

Trametinib DMSO solvate

A3887-50 ApexBio 50 mg 170.4 EUR

Dimethyl sulfoxide (DMSO)

D0231 Bio Basic 500ml 88.55 EUR

Trametinib (DMSO solvate)

HY-10999A MedChemExpress 100mg 256.8 EUR

Dry DMSO, 14ML

X022-14ML Arbor Assays 14ML 171.6 EUR

Dry DMSO, 20ML

X022-20ML Arbor Assays 20ML 232.8 EUR

Dry DMSO, 2ML

X022-2ML Arbor Assays 2ML 112.8 EUR

Dry DMSO, 4ML

X022-4ML Arbor Assays 4ML 139.2 EUR

Dry DMSO, 5ML

X022-5ML Arbor Assays 5ML 146.4 EUR

DMAO, 2mM in DMSO

40012 Biotium 1ML 355.2 EUR

EvaGreen, 2000X in DMSO

31019 Biotium 50uL 294 EUR

250mL DMSO Dimethyl Sulfoxide

25-950-CQC Scientific Laboratory Supplies EACH 102.6 EUR

LysoView 540, 1000X in DMSO

70061 Biotium 50uL 246 EUR

LysoView 540, 1000X in DMSO

70061-T Biotium 10uL 112.8 EUR

LysoViewâ„¢ 405, 1000X in DMSO

70066 Biotium 50uL 241.2 EUR

LysoViewâ„¢ 488, 1000X in DMSO

70067 Biotium 50uL 241.2 EUR

MitoViewâ„¢ 720, 1000X in DMSO

70068 Biotium 20X50UG 306 EUR

RedDot 2, 200X in DMSO

40061 Biotium 250uL 434.4 EUR

RedDot 2, 200X in DMSO

40061-1 Biotium 1mL 673.2 EUR

RedDot 2, 200X in DMSO

40061-T Biotium 25uL 157.2 EUR

Thiazole Orange, 10mM in DMSO

40077 Biotium 1mL 174 EUR

NucSpot 470, 1000X in DMSO

40083 Biotium 200uL 446.4 EUR

NucSpot 470, 1000X in DMSO

40083-T Biotium 20uL 127.2 EUR

Thiazole Red, 1mM in DMSO

40087 Biotium 1mL 384 EUR

Oxazole Yellow, 1mM in DMSO

40089 Biotium 1mL 403.2 EUR

DMSO, labeling grade, 1 mL

15050 Lumiprobe 1 mL 44.4 EUR

Peelbl DMSO Resistant AdhFoil sh

PCR0542 Scientific Laboratory Supplies PK100 265.62 EUR

DMSO Resistant Peel Seal Roll

PCR0852 Scientific Laboratory Supplies 1ROLL 1336.08 EUR

DMSO Resistant Peel Seal Roll

PCR0854 Scientific Laboratory Supplies 1ROLL 1470.6 EUR

DMSO Resistant Peel Seal Roll

PCR0856 Scientific Laboratory Supplies 1ROLL 19.87 EUR

DMSO Resistant Peel Seal Roll

PCR0858 Scientific Laboratory Supplies 1ROLL 318.06 EUR

DMSO Resistant Peel Seal Roll

PCR0860 Scientific Laboratory Supplies 1ROLL 1505.94 EUR

DMSO Resistant Peel Seal Roll

PCR0862 Scientific Laboratory Supplies 1ROLL 1656.42 EUR

DMSO Resistant Peel Seal Roll

PCR0864 Scientific Laboratory Supplies 1ROLL 19.28 EUR

Cycloheximide Solution (10% in DMSO Sterile)

C084-10x1ML TOKU-E 10x1 mL 232.8 EUR

Cycloheximide Solution (10% in DMSO Sterile)

C084-1ML TOKU-E 1 mL 64.8 EUR

TMRE, 2 mM solution in DMSO

70005 Biotium 0.5ML 178.8 EUR

6-TAMRA, SE in DMSO:100uL

90097 Biotium 100uL 368.4 EUR

6-Rox, SE in DMSO:(100uL)

90098 Biotium 100uL 368.4 EUR

EGTA AM *10 mM DMSO solution*

21006 AAT Bioquest 1 mL 211.2 EUR

Ethidium homodimer I, 2mM DMSO solution

40014 Biotium 0.5ML 308.4 EUR

Ethidium homodimer III, 1mM in DMSO

40051 Biotium 200uL 374.4 EUR

Thiazole Red Homodimer, 1mM in DMSO

40080 Biotium 200uL 426 EUR

NucSpot Live 488, 1000X in DMSO

40081 Biotium 50uL 426 EUR

NucSpot Live 488, 1000X in DMSO

40081-T Biotium 10uL 139.2 EUR

NucSpot Far-Red, 1000X in DMSO

40085 Biotium 0.5mL 675.6 EUR

NucSpot Far-Red, 1000X in DMSO

40085-T Biotium 50uL 157.2 EUR

Thiazole Green, 10, 000X in DMSO

40086-0.5mL Biotium 0.5mL 225.6 EUR

Thiazole Green, 10, 000X in DMSO

40086-1mL Biotium 1mL 344.4 EUR

Thiazole orange *10 mM in DMSO*

17519 AAT Bioquest 10 mL 138 EUR

Calcein AM, 4mm in anhydrous DMSO

80011-1 Biotium 100uL 271.2 EUR

DMSO Resistant Peel Seal 100 She

PCR0866 Scientific Laboratory Supplies PK100 94.62 EUR

CYTO-13 *5 mM DMSO solution*

17553 AAT Bioquest 0.5 mL 222 EUR

LAMP Green® *50X DMSO Solution*

17555 AAT Bioquest 100 ul 301 EUR

Q4ever™ Green *1250X DMSO Solution*

17608 AAT Bioquest 100 ul 151 EUR

Q4ever™ Green *1250X DMSO Solution*

17609 AAT Bioquest 2 ml 2029 EUR

Cyanine3.5 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO

32030 Lumiprobe 500 µl 218.4 EUR

Pluronic f-127 20% solution in DMSO

59004 Biotium 1ML 79.2 EUR

Cyanine5 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO

43030 Lumiprobe 1 ml 379.2 EUR

LysoViewâ„¢ 405, 1000X in DMSO, Trial Size

70066-T Biotium 10uL 111.6 EUR

LysoViewâ„¢ 488, 1000X in DMSO, Trial Size

70067-T Biotium 10uL 111.6 EUR

MitoViewâ„¢ 720, 1000X in DMSO, Trial Size

70068-T Biotium 50UG 124.8 EUR

Cyanine3.5 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO

42030 Lumiprobe 1 ml 379.2 EUR

Thiazole Orange Homodimer, 1 mM in DMSO

40079 Biotium 200uL 526.8 EUR

TO iodide (515/531), 1mM in DMSO

40088 Biotium 1mL 363.6 EUR

Cyanine5.5 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO

44030 Lumiprobe 1 ml 379.2 EUR

Cyanine3 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO

41030 Lumiprobe 10 mM/DMSO 379.2 EUR

Cyanine7 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO

35030 Lumiprobe 500 µl 218.4 EUR

Cyanine7.5 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO

36030 Lumiprobe 500 µl 218.4 EUR

Cyanine5.5 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO

34030 Lumiprobe 500 µl 218.4 EUR

Cyanine3 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO

11030 Lumiprobe 10 mM/DMSO 129.6 EUR

Cyanine3 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO

31030 Lumiprobe 10 mM/DMSO 218.4 EUR

Cyanine5 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO

33030 Lumiprobe 500 µl 218.4 EUR

Cyanine7 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO

15030 Lumiprobe 100 µl 129.6 EUR

Cyanine7.5 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO

16030 Lumiprobe 100 µl 129.6 EUR

Cyanine3.5 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO

12030 Lumiprobe 100 µl 129.6 EUR

Cyanine5 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO

13030 Lumiprobe 100 µl 129.6 EUR

Calcein AM, 1mg/ml in anhydrous DMSO

80011-2 Biotium 1ML 277.2 EUR

Phosphatase Inhibitor Cocktail I (100X in DMSO)

HY-K0021 MedChemExpress 1 mL × 10 494.4 EUR

Phosphatase Inhibitor Cocktail III (100X in DMSO)

HY-K0023 MedChemExpress 1 mL × 50 2594.4 EUR

Deacetylase Inhibitor Cocktail (100× in 70% DMSO)

HY-K0030 MedChemExpress 1 mL × 10 334.8 EUR

Phosphatase Inhibitor Cocktail 1 (100X in DMSO)

K1012-1 ApexBio 1 ml 122.4 EUR

Phosphatase Inhibitor Cocktail 1 (100X in DMSO)

K1012-10 ApexBio 10x1 ml 498 EUR

Phosphatase Inhibitor Cocktail 1 (100X in DMSO)

K1012-100 ApexBio 100x1 ml 2829.6 EUR

Phosphatase Inhibitor Cocktail 1 (100X in DMSO)

K1012-50 ApexBio 50x1 ml 1910.4 EUR

Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 (100X in DMSO)

K1014-1 ApexBio 1 ml 135.6 EUR

Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 (100X in DMSO)

K1014-10 ApexBio 10x1 ml 609.6 EUR

Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 (100X in DMSO)

K1014-100 ApexBio 100x1 ml 3908.4 EUR

Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 (100X in DMSO)

K1014-50 ApexBio 50x1 ml 2620.8 EUR

Deacetylase Inhibitor Cocktail (100× in 70% DMSO)

K1017-1 ApexBio 1 ml 104.4 EUR

Deacetylase Inhibitor Cocktail (100× in 70% DMSO)

K1017-10 ApexBio 10x1 ml 282 EUR

Wraz z innymi informacjami strukturalnymi wygenerowaliśmy złożony model atomowy rusztowania pierścienia centralnego, który obejmuje NR, IR i CR. IR jest połączony z dwoma zewnętrznymi pierścieniami głównie przez Nup155. Model ten ułatwia funkcjonalne zrozumienie NPC kręgowców.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany. Wymagane pola są oznaczone *