Postępy Cryo-EM w określaniu struktury RNA
Niedawno wykazaliśmy, w jaki sposób kropelki lipidów mogą służyć jako dane in situ do korelowania zestawów danych z mikroskopii kriofluorescencyjnej (cryo-FM) i krio-skoncentrowanej mikroskopii elektronowej ze skaningową wiązką jonów (cryo-FIB-SEM) komórek ssaków hodowanych na siatkach. Tutaj opisujemy krok po kroku protokół dla korelacji cryo-FM i krio-FIB-SEM, począwszy od przygotowania próbki linii komórkowej C2C12, a następnie obrazowania za pomocą cryo-FM i krio-FIB-SEM. Na koniec szczegółowo opisujemy, jak wykonać korelację 3D z dokładnością submikronową. Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wykorzystania i wykonania tego profilu, prosimy zapoznać się z Scher et al. (2021).
Receptor związany z sortowaniem z powtórzeniami typu A (SORLA) jest ważnym receptorem regulującym normalne funkcje komórkowe poprzez sortowanie białek.
Tutaj określiliśmy struktury pełnej długości SORLA i zidentyfikowaliśmy dwie różne konformacje apo-SORLA przy użyciu jednocząsteczkowej kriogenicznej mikroskopii elektronowej. W przeciwieństwie do białek homologicznych, zarówno formy monomeryczne, jak i dimeryczne SORLA istniały w roztworze obojętnym.
- Tylko trzy wiązania wodorowe w pobliżu granicy faz dimeru sugerowały udział w dimeryzacji. Orientacja reszty R490 była kluczowym punktem dla wiązania liganda. Wyniki te sugerują unikalny mechanizm dimeryzacji SORLA w transporcie białek.
- Mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM) okazała się bezprecedensowym narzędziem do rozpoznawania struktur białkowych w rozdzielczości atomowej. Wglądy strukturalne próbek biologicznych niedostępne w konwencjonalnej krystalografii rentgenowskiej i NMR można badać za pomocą krio-EM, ponieważ pomiary są przeprowadzane w warunkach zbliżonych do natywnych, wolnych od kryształów, a duże kompleksy białkowe o niejednorodności konformacyjnej i składowej są łatwo rozwiązywane.
- RNA pozostaje niedostatecznie zbadane w krio-EM, pomimo jego zasadniczej roli w różnych procesach biologicznych. W tym przeglądzie podkreślono obecne wyzwania i niedawne postępy w stosowaniu analizy krio-EM pojedynczych cząstek do określania struktur RNA wolnych od białek, co umożliwiło udoskonalenie przygotowywania próbek i integracja wielu metod strukturalnych i biochemicznych.
- Konserwatywna ATP-aza p97 (Cdc48 u drożdży) i adaptery pośredniczą w różnych procesach komórkowych poprzez rozkładanie poliubikwitynowanych białek i ekstrakcję ich z zespołów makromolekularnych i błon w celu ich dezagregacji i degradacji.
- Tandemowe domeny ATPazy (D1 i D2) heksameru p97/Cdc48 tworzą ułożone w stos pierścienie. p97/Cdc48 może rozwijać substraty poprzez przewleczenie ich przez centralny por. Pętle porów krytyczne dla rozwinięcia substratu nie są jednak dobrze uporządkowane w konformacjach p97/Cdc48 bez substratu.
- Nie jest jasne, w jaki sposób p97/Cdc48 organizuje swoje pętle porów pod kątem zaangażowania substratu. Tutaj pokazujemy, że p97/Cdc48 może tworzyć podwójne heksamery (DH) połączone pierścieniem D2. Struktury Cryo-EM p97 DH wykazują konformację kompetentną dla ATPazy z uporządkowanymi pętlami porów.
- Rozszerzenie C-końcowe (CTE) łączy sąsiednie D2 w każdym heksamerze i rozszerza centralny por pierścienia D2. Mutacje Cdc48 CTE znoszą rozwój substratu. Proponujemy, aby p97/Cdc48 DH wychwytywał stan wzmocniony gotowy do zaangażowania substratu.
U bifidobakterii fosfoketolaza (PKT) odgrywa kluczową rolę w centralnej ścieżce fermentacji heksozy zwanej „przeciekiem bifidowym”.
Trójwymiarową strukturę PKT z Bifidobacterium longum z koenzymem difosforanu tiaminy (ThDpp) określono z rozdzielczością 2,1 Å za pomocą analizy pojedynczych cząstek cryo-EM z użyciem 196 147 cząstek w celu zbudowania modelu strukturalnego oktameru PKT powiązanego symetrią D4 . Chociaż struktura krio-EM PKT była prawie identyczna z rentgenowską strukturą krystaliczną wcześniej określoną przy rozdzielczości 2,2 Å, w strukturze krio-EM zaobserwowano kilka interesujących cech strukturalnych.
Ponieważ struktura ta została rozwiązana przy stosunkowo wysokiej rozdzielczości, zaobserwowano, że kilka reszt aminokwasowych przyjmuje wiele konformacji. Wśród nich Q546-D547-H548-N549 (pętla QN) wykazują największą zmianę strukturalną, która wydaje się być związana z enzymatyczną funkcją PKT. Pętla QN znajduje się przy wejściu do kieszeni wiążącej podłoże. Mniejszy konformer pętli QN jest podobny do konformacji pętli QN w strukturze krystalicznej. Główny konformer znajduje się dalej od ThDpp niż mniejszy konformer.
Co ciekawe, główny konformer w strukturze krio-EM PKT przypomina odpowiednią strukturę pętli związanej z substratem transketolazy Escherichia coli. Oznacza to, że mniejszy i główny konformer mogą odpowiadać odpowiednio stanom „zamkniętym” i „otwartym” dla dostępu do substratu. Ponadto, dzięki analizie o wysokiej rozdzielczości, w strukturze krio-EM PKT zaobserwowano wiele cząsteczek wody. Omówiono cechy strukturalne cząsteczek wody w strukturze krio-EM i porównano je z cząsteczkami wody obserwowanymi w strukturze krystalicznej.
Kompleks porów jądrowych (NPC) przenosi ładunek przez otoczkę jądrową. Tutaj przedstawiamy jednocząstkową strukturę krio-EM podjednostki pierścienia jądrowego (NR) z Xenopus laevis NPC przy średniej rozdzielczości 5,6 Å. Podjednostka NR zawiera dwa 10-członowe kompleksy Y, każdy z nukleoporyną ELYS blisko związaną z Nup160 i Nup37 długiego ramienia.
W przeciwieństwie do pierścienia cytoplazmatycznego (CR) lub pierścienia wewnętrznego (IR), podjednostka NR zawiera tylko jedną cząsteczkę Nup205 i Nup93. Nup205 wiąże oba ramiona kompleksów Y i oddziałuje z rdzeniem wewnętrznego kompleksu Y z sąsiedniej podjednostki. Nup93 łączy trzony wewnętrznych i zewnętrznych kompleksów Y w tej samej podjednostce NR i umieszcza swoją wydłużoną helisę na końcu N w osiowym rowku Nup205 z sąsiedniej podjednostki.
CryoSure-DMSO |
|||
| WAK-DMSO-10 | WakChemie | 10x10 ml | 266.05 EUR |
DMSO, anhydrous |
|||
| 90082 | Biotium | 10ML | 73 EUR |
Dry DMSO, 14ML |
|||
| X022-14ML | Arbor Assays | 14ML | 143 EUR |
Dry DMSO, 20ML |
|||
| X022-20ML | Arbor Assays | 20ML | 194 EUR |
Dry DMSO, 2ML |
|||
| X022-2ML | Arbor Assays | 2ML | 94 EUR |
Dry DMSO, 4ML |
|||
| X022-4ML | Arbor Assays | 4ML | 116 EUR |
Dry DMSO, 5ML |
|||
| X022-5ML | Arbor Assays | 5ML | 122 EUR |
Trametinib (DMSO solvate) |
|||
| HY-10999A | MedChemExpress | 100mg | 214 EUR |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) |
|||
| D0231 | Bio Basic | 500ml | 73.79 EUR |
Trametinib DMSO solvate |
|||
| A3887-10 | ApexBio | 10 mg | 108 EUR |
Trametinib DMSO solvate |
|||
| A3887-100 | ApexBio | 100 mg | 187 EUR |
Trametinib DMSO solvate |
|||
| A3887-5.1 | ApexBio | 10 mM (in 1mL DMSO) | 113 EUR |
Trametinib DMSO solvate |
|||
| A3887-50 | ApexBio | 50 mg | 142 EUR |
EvaGreen, 2000X in DMSO |
|||
| 31019 | Biotium | 50uL | 245 EUR |
DMAO, 2mM in DMSO |
|||
| 40012 | Biotium | 1ML | 296 EUR |
RedDot 2, 200X in DMSO |
|||
| 40061 | Biotium | 250uL | 362 EUR |
RedDot 2, 200X in DMSO |
|||
| 40061-1 | Biotium | 1mL | 561 EUR |
RedDot 2, 200X in DMSO |
|||
| 40061-T | Biotium | 25uL | 131 EUR |
Thiazole Orange, 10mM in DMSO |
|||
| 40077 | Biotium | 1mL | 145 EUR |
NucSpot 470, 1000X in DMSO |
|||
| 40083 | Biotium | 200uL | 372 EUR |
NucSpot 470, 1000X in DMSO |
|||
| 40083-T | Biotium | 20uL | 106 EUR |
Thiazole Red, 1mM in DMSO |
|||
| 40087 | Biotium | 1mL | 320 EUR |
Oxazole Yellow, 1mM in DMSO |
|||
| 40089 | Biotium | 1mL | 336 EUR |
LysoView 540, 1000X in DMSO |
|||
| 70061 | Biotium | 50uL | 205 EUR |
LysoView 540, 1000X in DMSO |
|||
| 70061-T | Biotium | 10uL | 94 EUR |
LysoViewâ„¢ 405, 1000X in DMSO |
|||
| 70066 | Biotium | 50uL | 201 EUR |
LysoViewâ„¢ 488, 1000X in DMSO |
|||
| 70067 | Biotium | 50uL | 201 EUR |
MitoViewâ„¢ 720, 1000X in DMSO |
|||
| 70068 | Biotium | 20X50UG | 255 EUR |
250 ML DMSO (DIMETHYL SULFOXIDE) |
|||
| 25-950-CQC | CORNING | 250 mL/pk | 94 EUR |
DMSO, labeling grade, 1 mL |
|||
| 15050 | Lumiprobe | 1 mL | 37 EUR |
Thiazole orange *10 mM in DMSO* |
|||
| 17519 | AAT Bioquest | 10 mL | 115 EUR |
EGTA AM *10 mM DMSO solution* |
|||
| 21006 | AAT Bioquest | 1 mL | 176 EUR |
Ethidium homodimer I, 2mM DMSO solution |
|||
| 40014 | Biotium | 0.5ML | 257 EUR |
Ethidium homodimer III, 1mM in DMSO |
|||
| 40051 | Biotium | 200uL | 312 EUR |
Thiazole Red Homodimer, 1mM in DMSO |
|||
| 40080 | Biotium | 200uL | 355 EUR |
NucSpot Live 488, 1000X in DMSO |
|||
| 40081 | Biotium | 50uL | 355 EUR |
NucSpot Live 488, 1000X in DMSO |
|||
| 40081-T | Biotium | 10uL | 116 EUR |
NucSpot Far-Red, 1000X in DMSO |
|||
| 40085 | Biotium | 0.5mL | 563 EUR |
NucSpot Far-Red, 1000X in DMSO |
|||
| 40085-T | Biotium | 50uL | 131 EUR |
Thiazole Green, 10, 000X in DMSO |
|||
| 40086-0.5mL | Biotium | 0.5mL | 188 EUR |
Thiazole Green, 10, 000X in DMSO |
|||
| 40086-1mL | Biotium | 1mL | 287 EUR |
TMRE, 2 mM solution in DMSO |
|||
| 70005 | Biotium | 0.5ML | 149 EUR |
Calcein AM, 4mm in anhydrous DMSO |
|||
| 80011-1 | Biotium | 100uL | 226 EUR |
6-TAMRA, SE in DMSO:100uL |
|||
| 90097 | Biotium | 100uL | 307 EUR |
6-Rox, SE in DMSO:(100uL) |
|||
| 90098 | Biotium | 100uL | 307 EUR |
Cycloheximide Solution (10% in DMSO Sterile) |
|||
| C084-10x1ML | TOKU-E | 10x1 mL | 194 EUR |
Cycloheximide Solution (10% in DMSO Sterile) |
|||
| C084-1ML | TOKU-E | 1 mL | 54 EUR |
Phosphatase Inhibitor Cocktail I (100X in DMSO) |
|||
| HY-K0021 | MedChemExpress | 1 mL × 10 | 412 EUR |
Phosphatase Inhibitor Cocktail III (100X in DMSO) |
|||
| HY-K0023 | MedChemExpress | 1 mL × 50 | 2162 EUR |
Deacetylase Inhibitor Cocktail (100× in 70% DMSO) |
|||
| HY-K0030 | MedChemExpress | 1 mL × 10 | 279 EUR |
Thiazole Orange Homodimer, 1 mM in DMSO |
|||
| 40079 | Biotium | 200uL | 439 EUR |
TO iodide (515/531), 1mM in DMSO |
|||
| 40088 | Biotium | 1mL | 303 EUR |
Pluronic f-127 20% solution in DMSO |
|||
| 59004 | Biotium | 1ML | 66 EUR |
LysoViewâ„¢ 405, 1000X in DMSO, Trial Size |
|||
| 70066-T | Biotium | 10uL | 93 EUR |
LysoViewâ„¢ 488, 1000X in DMSO, Trial Size |
|||
| 70067-T | Biotium | 10uL | 93 EUR |
MitoViewâ„¢ 720, 1000X in DMSO, Trial Size |
|||
| 70068-T | Biotium | 50UG | 104 EUR |
Calcein AM, 1mg/ml in anhydrous DMSO |
|||
| 80011-2 | Biotium | 1ML | 231 EUR |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 1 (100X in DMSO) |
|||
| K1012-1 | ApexBio | 1 ml | 102 EUR |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 1 (100X in DMSO) |
|||
| K1012-50 | ApexBio | 50x1 ml | 1592 EUR |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 (100X in DMSO) |
|||
| K1014-1 | ApexBio | 1 ml | 113 EUR |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 (100X in DMSO) |
|||
| K1014-50 | ApexBio | 50x1 ml | 2184 EUR |
Deacetylase Inhibitor Cocktail (100× in 70% DMSO) |
|||
| K1017-1 | ApexBio | 1 ml | 87 EUR |
Deacetylase Inhibitor Cocktail (100× in 70% DMSO) |
|||
| K1017-50 | ApexBio | 50x1 ml | 792 EUR |
Cyanine5.5 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO |
|||
| 34030 | Lumiprobe | 500 µl | 182 EUR |
Cyanine7 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO |
|||
| 35030 | Lumiprobe | 500 µl | 182 EUR |
Cyanine7.5 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO |
|||
| 36030 | Lumiprobe | 500 µl | 182 EUR |
Cyanine3 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO |
|||
| 41030 | Lumiprobe | 10 mM/DMSO | 316 EUR |
Cyanine3.5 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO |
|||
| 42030 | Lumiprobe | 1 ml | 316 EUR |
Cyanine5 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO |
|||
| 43030 | Lumiprobe | 1 ml | 316 EUR |
Cyanine5.5 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO |
|||
| 44030 | Lumiprobe | 1 ml | 316 EUR |
Cyanine7 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO |
|||
| 45030 | Lumiprobe | 1 mL | 316 EUR |
Cyanine3 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO |
|||
| 11030 | Lumiprobe | 10 mM/DMSO | 108 EUR |
Cyanine3.5 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO |
|||
| 12030 | Lumiprobe | 100 µl | 108 EUR |
Cyanine5 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO |
|||
| 13030 | Lumiprobe | 100 µl | 108 EUR |
Cyanine5.5 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO |
|||
| 14030 | Lumiprobe | 100 µl | 108 EUR |
Cyanine7 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO |
|||
| 15030 | Lumiprobe | 100 µl | 108 EUR |
Cyanine7.5 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO |
|||
| 16030 | Lumiprobe | 100 µl | 108 EUR |
Cyanine3 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO |
|||
| 31030 | Lumiprobe | 10 mM/DMSO | 182 EUR |
Cyanine3.5 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO |
|||
| 32030 | Lumiprobe | 500 µl | 182 EUR |
Cyanine5 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO |
|||
| 33030 | Lumiprobe | 500 µl | 182 EUR |
EZBlock? Protease Inhibitor Cocktail VIII, DMSO-Free |
|||
| K395-1 | Biovision | 126 EUR | |
EZBlock? Protease Inhibitor Cocktail VIII, DMSO-Free |
|||
| K395-set | Biovision | 392 EUR | |
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 100X in DMSO) |
|||
| HY-K0010 | MedChemExpress | 1 mL × 100 | 1772 EUR |
Fluo-3, AM ester, 1mm in anhydrous DMSO |
|||
| 50015 | Biotium | 1ML | 259 EUR |
Fura-2, AM ester, 1mm in anhydrous DMSO |
|||
| 50029 | Biotium | 1ML | 222 EUR |
BCECF, AM ester 1mg/ml in dry DMSO |
|||
| 51009 | Biotium | 1ML | 155 EUR |
NucView 488 Caspase-3 Substrate, 1mM in DMSO |
|||
| 10402 | Biotium | 100uL | 396 EUR |
NucView 488 Caspase-3 Substrate, 1mM in DMSO |
|||
| 10402-T | Biotium | 10uL | 120 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail(EDTA-Free,100X in DMSO) |
|||
| K1007-1 | ApexBio | 1 ml | 81 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail(EDTA-Free,100X in DMSO) |
|||
| K1007-20 | ApexBio | 20x1 ml | 514 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail(EDTA-Free,100X in DMSO) |
|||
| K1007-50 | ApexBio | 50x1 ml | 1094 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 200X in DMSO) |
|||
| K1008-1 | ApexBio | 1 ml | 81 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 200X in DMSO) |
|||
| K1008-20 | ApexBio | 20x1 ml | 514 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 200X in DMSO) |
|||
| K1008-50 | ApexBio | 50x1 ml | 1094 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 100X in DMSO) |
|||
| K1009-1 | ApexBio | 1 ml | 90 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 100X in DMSO) |
|||
| K1009-50 | ApexBio | 50x1 ml | 1210 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 100X in DMSO) |
|||
| K1010-1 | ApexBio | 1 ml | 90 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 100X in DMSO) |
|||
| K1010-50 | ApexBio | 50x1 ml | 1210 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 100X in DMSO) |
|||
| K1011-1 | ApexBio | 1 ml | 90 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 100X in DMSO) |
|||
| K1011-50 | ApexBio | 50x1 ml | 1210 EUR |
Wraz z innymi informacjami strukturalnymi wygenerowaliśmy złożony model atomowy rusztowania pierścienia centralnego, który obejmuje NR, IR i CR. IR jest połączony z dwoma zewnętrznymi pierścieniami głównie przez Nup155. Model ten ułatwia funkcjonalne zrozumienie NPC kręgowców.