Ewa Agro Art Badania

Postępy Cryo-EM w określaniu struktury RNA

• Ewa
• 9 czerwca, 202210 czerwca, 2022
• 0

Niedawno wykazaliśmy, w jaki sposób kropelki lipidów mogą służyć jako  dane in situ  do korelowania zestawów danych z mikroskopii kriofluorescencyjnej (cryo-FM) i krio-skoncentrowanej mikroskopii elektronowej ze skaningową wiązką jonów (cryo-FIB-SEM) komórek ssaków hodowanych na siatkach. Tutaj opisujemy krok po kroku protokół dla korelacji cryo-FM i krio-FIB-SEM, począwszy od przygotowania próbki linii komórkowej C2C12, a następnie obrazowania za pomocą cryo-FM i krio-FIB-SEM. Na koniec szczegółowo opisujemy, jak wykonać korelację 3D z dokładnością submikronową. Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wykorzystania i wykonania tego profilu, prosimy zapoznać się z Scher et al. (2021).

Receptor związany z sortowaniem z powtórzeniami typu A (SORLA) jest ważnym receptorem regulującym normalne funkcje komórkowe poprzez sortowanie białek.

Tutaj określiliśmy struktury pełnej długości SORLA i zidentyfikowaliśmy dwie różne konformacje apo-SORLA przy użyciu jednocząsteczkowej kriogenicznej mikroskopii elektronowej. W przeciwieństwie do białek homologicznych, zarówno formy monomeryczne, jak i dimeryczne SORLA istniały w roztworze obojętnym.

• Tylko trzy wiązania wodorowe w pobliżu granicy faz dimeru sugerowały udział w dimeryzacji. Orientacja reszty R490 była kluczowym punktem dla wiązania liganda. Wyniki te sugerują unikalny mechanizm dimeryzacji SORLA w transporcie białek.
• Mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM) okazała się bezprecedensowym narzędziem do rozpoznawania struktur białkowych w rozdzielczości atomowej. Wglądy strukturalne próbek biologicznych niedostępne w konwencjonalnej krystalografii rentgenowskiej i NMR można badać za pomocą krio-EM, ponieważ pomiary są przeprowadzane w warunkach zbliżonych do natywnych, wolnych od kryształów, a duże kompleksy białkowe o niejednorodności konformacyjnej i składowej są łatwo rozwiązywane.
• RNA pozostaje niedostatecznie zbadane w krio-EM, pomimo jego zasadniczej roli w różnych procesach biologicznych. W tym przeglądzie podkreślono obecne wyzwania i niedawne postępy w stosowaniu analizy krio-EM pojedynczych cząstek do określania struktur RNA wolnych od białek, co umożliwiło udoskonalenie przygotowywania próbek i integracja wielu metod strukturalnych i biochemicznych.
• Konserwatywna ATP-aza p97 (Cdc48 u drożdży) i adaptery pośredniczą w różnych procesach komórkowych poprzez rozkładanie poliubikwitynowanych białek i ekstrakcję ich z zespołów makromolekularnych i błon w celu ich dezagregacji i degradacji.
• Tandemowe domeny ATPazy (D1 i D2) heksameru p97/Cdc48 tworzą ułożone w stos pierścienie. p97/Cdc48 może rozwijać substraty poprzez przewleczenie ich przez centralny por. Pętle porów krytyczne dla rozwinięcia substratu nie są jednak dobrze uporządkowane w konformacjach p97/Cdc48 bez substratu.
• Nie jest jasne, w jaki sposób p97/Cdc48 organizuje swoje pętle porów pod kątem zaangażowania substratu. Tutaj pokazujemy, że p97/Cdc48 może tworzyć podwójne heksamery (DH) połączone pierścieniem D2. Struktury Cryo-EM p97 DH wykazują konformację kompetentną dla ATPazy z uporządkowanymi pętlami porów.
• Rozszerzenie C-końcowe (CTE) łączy sąsiednie D2 w każdym heksamerze i rozszerza centralny por pierścienia D2. Mutacje Cdc48 CTE znoszą rozwój substratu. Proponujemy, aby p97/Cdc48 DH wychwytywał stan wzmocniony gotowy do zaangażowania substratu.

 

U bifidobakterii fosfoketolaza (PKT) odgrywa kluczową rolę w centralnej ścieżce fermentacji heksozy zwanej „przeciekiem bifidowym”.

Trójwymiarową strukturę PKT z Bifidobacterium longum z koenzymem difosforanu tiaminy (ThDpp) określono z rozdzielczością 2,1 Å za pomocą analizy pojedynczych cząstek cryo-EM z użyciem 196 147 cząstek w celu zbudowania modelu strukturalnego oktameru PKT powiązanego symetrią D4 . Chociaż struktura krio-EM PKT była prawie identyczna z rentgenowską strukturą krystaliczną wcześniej określoną przy rozdzielczości 2,2 Å, w strukturze krio-EM zaobserwowano kilka interesujących cech strukturalnych.

Ponieważ struktura ta została rozwiązana przy stosunkowo wysokiej rozdzielczości, zaobserwowano, że kilka reszt aminokwasowych przyjmuje wiele konformacji. Wśród nich Q546-D547-H548-N549 (pętla QN) wykazują największą zmianę strukturalną, która wydaje się być związana z enzymatyczną funkcją PKT. Pętla QN znajduje się przy wejściu do kieszeni wiążącej podłoże. Mniejszy konformer pętli QN jest podobny do konformacji pętli QN w strukturze krystalicznej. Główny konformer znajduje się dalej od ThDpp niż mniejszy konformer.

Co ciekawe, główny konformer w strukturze krio-EM PKT przypomina odpowiednią strukturę pętli związanej z substratem transketolazy Escherichia coli. Oznacza to, że mniejszy i główny konformer mogą odpowiadać odpowiednio stanom „zamkniętym” i „otwartym” dla dostępu do substratu. Ponadto, dzięki analizie o wysokiej rozdzielczości, w strukturze krio-EM PKT zaobserwowano wiele cząsteczek wody. Omówiono cechy strukturalne cząsteczek wody w strukturze krio-EM i porównano je z cząsteczkami wody obserwowanymi w strukturze krystalicznej.

Kompleks porów jądrowych (NPC) przenosi ładunek przez otoczkę jądrową. Tutaj przedstawiamy jednocząstkową strukturę krio-EM podjednostki pierścienia jądrowego (NR) z Xenopus laevis NPC przy średniej rozdzielczości 5,6 Å. Podjednostka NR zawiera dwa 10-członowe kompleksy Y, każdy z nukleoporyną ELYS blisko związaną z Nup160 i Nup37 długiego ramienia.

W przeciwieństwie do pierścienia cytoplazmatycznego (CR) lub pierścienia wewnętrznego (IR), podjednostka NR zawiera tylko jedną cząsteczkę Nup205 i Nup93. Nup205 wiąże oba ramiona kompleksów Y i oddziałuje z rdzeniem wewnętrznego kompleksu Y z sąsiedniej podjednostki. Nup93 łączy trzony wewnętrznych i zewnętrznych kompleksów Y w tej samej podjednostce NR i umieszcza swoją wydłużoną helisę na końcu N w osiowym rowku Nup205 z sąsiedniej podjednostki.

CryoSure-DMSO
WAK-DMSO-10	WakChemie	10x10 ml	319.26 EUR
250 ug/mL Nitromethane in DMSO
USP-S2722-DMSO	Scientific Laboratory Supplies	1ML	98.04 EUR
3600 ug/mL Tetrahyrdofuran in DMSO
USP-S3460-DMSO	Scientific Laboratory Supplies	1ML	98.04 EUR
3100 ug/mL Ethylene Glycol in DMSO
USP-S1952-DMSO	Scientific Laboratory Supplies	1ML	98.04 EUR
50000 ug/mL 111-Trichloroethane in DMSO
USP-S3605-DMSO	Scientific Laboratory Supplies	1ML	98.04 EUR
1900 ug/mL 1 4-Dioxane in DMSO
USP-S1715-DMSO	Scientific Laboratory Supplies	1ML	98.04 EUR
DMSO, anhydrous
90082	Biotium	10ML	87.6 EUR
Trametinib DMSO solvate
A3887-10	ApexBio	10 mg	129.6 EUR
Trametinib DMSO solvate
A3887-100	ApexBio	100 mg	224.4 EUR
Trametinib DMSO solvate
A3887-5.1	ApexBio	10 mM (in 1mL DMSO)	135.6 EUR
Trametinib DMSO solvate
A3887-50	ApexBio	50 mg	170.4 EUR
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
D0231	Bio Basic	500ml	88.55 EUR
Trametinib (DMSO solvate)
HY-10999A	MedChemExpress	100mg	256.8 EUR
Dry DMSO, 14ML
X022-14ML	Arbor Assays	14ML	171.6 EUR
Dry DMSO, 20ML
X022-20ML	Arbor Assays	20ML	232.8 EUR
Dry DMSO, 2ML
X022-2ML	Arbor Assays	2ML	112.8 EUR
Dry DMSO, 4ML
X022-4ML	Arbor Assays	4ML	139.2 EUR
Dry DMSO, 5ML
X022-5ML	Arbor Assays	5ML	146.4 EUR
DMAO, 2mM in DMSO
40012	Biotium	1ML	355.2 EUR
EvaGreen, 2000X in DMSO
31019	Biotium	50uL	294 EUR
250mL DMSO Dimethyl Sulfoxide
25-950-CQC	Scientific Laboratory Supplies	EACH	102.6 EUR
LysoView 540, 1000X in DMSO
70061	Biotium	50uL	246 EUR
LysoView 540, 1000X in DMSO
70061-T	Biotium	10uL	112.8 EUR
LysoViewâ„¢ 405, 1000X in DMSO
70066	Biotium	50uL	241.2 EUR
LysoViewâ„¢ 488, 1000X in DMSO
70067	Biotium	50uL	241.2 EUR
MitoViewâ„¢ 720, 1000X in DMSO
70068	Biotium	20X50UG	306 EUR
RedDot 2, 200X in DMSO
40061	Biotium	250uL	434.4 EUR
RedDot 2, 200X in DMSO
40061-1	Biotium	1mL	673.2 EUR
RedDot 2, 200X in DMSO
40061-T	Biotium	25uL	157.2 EUR
Thiazole Orange, 10mM in DMSO
40077	Biotium	1mL	174 EUR
NucSpot 470, 1000X in DMSO
40083	Biotium	200uL	446.4 EUR
NucSpot 470, 1000X in DMSO
40083-T	Biotium	20uL	127.2 EUR
Thiazole Red, 1mM in DMSO
40087	Biotium	1mL	384 EUR
Oxazole Yellow, 1mM in DMSO
40089	Biotium	1mL	403.2 EUR
DMSO, labeling grade, 1 mL
15050	Lumiprobe	1 mL	44.4 EUR
Peelbl DMSO Resistant AdhFoil sh
PCR0542	Scientific Laboratory Supplies	PK100	265.62 EUR
DMSO Resistant Peel Seal Roll
PCR0852	Scientific Laboratory Supplies	1ROLL	1336.08 EUR
DMSO Resistant Peel Seal Roll
PCR0854	Scientific Laboratory Supplies	1ROLL	1470.6 EUR
DMSO Resistant Peel Seal Roll
PCR0856	Scientific Laboratory Supplies	1ROLL	19.87 EUR
DMSO Resistant Peel Seal Roll
PCR0858	Scientific Laboratory Supplies	1ROLL	318.06 EUR
DMSO Resistant Peel Seal Roll
PCR0860	Scientific Laboratory Supplies	1ROLL	1505.94 EUR
DMSO Resistant Peel Seal Roll
PCR0862	Scientific Laboratory Supplies	1ROLL	1656.42 EUR
DMSO Resistant Peel Seal Roll
PCR0864	Scientific Laboratory Supplies	1ROLL	19.28 EUR
Cycloheximide Solution (10% in DMSO Sterile)
C084-10x1ML	TOKU-E	10x1 mL	232.8 EUR
Cycloheximide Solution (10% in DMSO Sterile)
C084-1ML	TOKU-E	1 mL	64.8 EUR
TMRE, 2 mM solution in DMSO
70005	Biotium	0.5ML	178.8 EUR
6-TAMRA, SE in DMSO:100uL
90097	Biotium	100uL	368.4 EUR
6-Rox, SE in DMSO:(100uL)
90098	Biotium	100uL	368.4 EUR
EGTA AM *10 mM DMSO solution*
21006	AAT Bioquest	1 mL	211.2 EUR
Ethidium homodimer I, 2mM DMSO solution
40014	Biotium	0.5ML	308.4 EUR
Ethidium homodimer III, 1mM in DMSO
40051	Biotium	200uL	374.4 EUR
Thiazole Red Homodimer, 1mM in DMSO
40080	Biotium	200uL	426 EUR
NucSpot Live 488, 1000X in DMSO
40081	Biotium	50uL	426 EUR
NucSpot Live 488, 1000X in DMSO
40081-T	Biotium	10uL	139.2 EUR
NucSpot Far-Red, 1000X in DMSO
40085	Biotium	0.5mL	675.6 EUR
NucSpot Far-Red, 1000X in DMSO
40085-T	Biotium	50uL	157.2 EUR
Thiazole Green, 10, 000X in DMSO
40086-0.5mL	Biotium	0.5mL	225.6 EUR
Thiazole Green, 10, 000X in DMSO
40086-1mL	Biotium	1mL	344.4 EUR
Thiazole orange *10 mM in DMSO*
17519	AAT Bioquest	10 mL	138 EUR
Calcein AM, 4mm in anhydrous DMSO
80011-1	Biotium	100uL	271.2 EUR
DMSO Resistant Peel Seal 100 She
PCR0866	Scientific Laboratory Supplies	PK100	94.62 EUR
CYTO-13 *5 mM DMSO solution*
17553	AAT Bioquest	0.5 mL	222 EUR
LAMP Green® *50X DMSO Solution*
17555	AAT Bioquest	100 ul	301 EUR
Q4ever™ Green *1250X DMSO Solution*
17608	AAT Bioquest	100 ul	151 EUR
Q4ever™ Green *1250X DMSO Solution*
17609	AAT Bioquest	2 ml	2029 EUR
Cyanine3.5 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO
32030	Lumiprobe	500 µl	218.4 EUR
Pluronic f-127 20% solution in DMSO
59004	Biotium	1ML	79.2 EUR
Cyanine5 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO
43030	Lumiprobe	1 ml	379.2 EUR
LysoViewâ„¢ 405, 1000X in DMSO, Trial Size
70066-T	Biotium	10uL	111.6 EUR
LysoViewâ„¢ 488, 1000X in DMSO, Trial Size
70067-T	Biotium	10uL	111.6 EUR
MitoViewâ„¢ 720, 1000X in DMSO, Trial Size
70068-T	Biotium	50UG	124.8 EUR
Cyanine3.5 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO
42030	Lumiprobe	1 ml	379.2 EUR
Thiazole Orange Homodimer, 1 mM in DMSO
40079	Biotium	200uL	526.8 EUR
TO iodide (515/531), 1mM in DMSO
40088	Biotium	1mL	363.6 EUR
Cyanine5.5 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO
44030	Lumiprobe	1 ml	379.2 EUR
Cyanine3 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO
41030	Lumiprobe	10 mM/DMSO	379.2 EUR
Cyanine7 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO
35030	Lumiprobe	500 µl	218.4 EUR
Cyanine7.5 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO
36030	Lumiprobe	500 µl	218.4 EUR
Cyanine5.5 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO
34030	Lumiprobe	500 µl	218.4 EUR
Cyanine3 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO
11030	Lumiprobe	10 mM/DMSO	129.6 EUR
Cyanine3 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO
31030	Lumiprobe	10 mM/DMSO	218.4 EUR
Cyanine5 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO
33030	Lumiprobe	500 µl	218.4 EUR
Cyanine7 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO
15030	Lumiprobe	100 µl	129.6 EUR
Cyanine7.5 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO
16030	Lumiprobe	100 µl	129.6 EUR
Cyanine3.5 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO
12030	Lumiprobe	100 µl	129.6 EUR
Cyanine5 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO
13030	Lumiprobe	100 µl	129.6 EUR
Calcein AM, 1mg/ml in anhydrous DMSO
80011-2	Biotium	1ML	277.2 EUR
Phosphatase Inhibitor Cocktail I (100X in DMSO)
HY-K0021	MedChemExpress	1 mL × 10	494.4 EUR
Phosphatase Inhibitor Cocktail III (100X in DMSO)
HY-K0023	MedChemExpress	1 mL × 50	2594.4 EUR
Deacetylase Inhibitor Cocktail (100× in 70% DMSO)
HY-K0030	MedChemExpress	1 mL × 10	334.8 EUR
Phosphatase Inhibitor Cocktail 1 (100X in DMSO)
K1012-1	ApexBio	1 ml	122.4 EUR
Phosphatase Inhibitor Cocktail 1 (100X in DMSO)
K1012-10	ApexBio	10x1 ml	498 EUR
Phosphatase Inhibitor Cocktail 1 (100X in DMSO)
K1012-100	ApexBio	100x1 ml	2829.6 EUR
Phosphatase Inhibitor Cocktail 1 (100X in DMSO)
K1012-50	ApexBio	50x1 ml	1910.4 EUR
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 (100X in DMSO)
K1014-1	ApexBio	1 ml	135.6 EUR
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 (100X in DMSO)
K1014-10	ApexBio	10x1 ml	609.6 EUR
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 (100X in DMSO)
K1014-100	ApexBio	100x1 ml	3908.4 EUR
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 (100X in DMSO)
K1014-50	ApexBio	50x1 ml	2620.8 EUR
Deacetylase Inhibitor Cocktail (100× in 70% DMSO)
K1017-1	ApexBio	1 ml	104.4 EUR
Deacetylase Inhibitor Cocktail (100× in 70% DMSO)
K1017-10	ApexBio	10x1 ml	282 EUR

Wraz z innymi informacjami strukturalnymi wygenerowaliśmy złożony model atomowy rusztowania pierścienia centralnego, który obejmuje NR, IR i CR. IR jest połączony z dwoma zewnętrznymi pierścieniami głównie przez Nup155. Model ten ułatwia funkcjonalne zrozumienie NPC kręgowców.