Strukturalne wglądy w rozpoznawanie metylowanego DNA przez domenę wiążącą metyl-CpG MBD6 z Arabidopsis thaliana
Metylacja cytozyny jest modyfikacją epigenetyczną niezbędną do tworzenia dojrzałej heterochromatyny, wyciszania genów i stabilności genomu. W roślinach metylacja zachodzi nie tylko w obrębie zasad cytozyny w CpG, ale także w kontekstach CpHpG i CpHpH, gdzie H oznacza A, T lub C. Białka z domeną wiążącą metyl-CpG (MBD), które rozpoznają symetryczne dinukleotydy represory genów w komórkach ssaków są również obecne w komórkach roślinnych, chociaż ich właściwości strukturalne i funkcjonalne wciąż pozostają słabo poznane.
Aby wypełnić tę lukę, w tym badaniu określiliśmy strukturę roztworu domeny MBD białka MBD6 z Arabidopsis thaliana i zbadaliśmy jego właściwości wiązania z metylowanym DNA za pomocą testów wiązania i dogłębnej analizy spektroskopowej NMR. Domena AtMBD6 MBD fałduje się w kanoniczną strukturę MBD zgodnie ze swoistością wiązania z metylo-CpG i posiada interfejs wiązania DNA podobny do ssaczych domen MBD.
Co jednak intrygujące, stwierdzono, że powinowactwo wiązania domeny MBD AtMBD6 z DNA zawierającym metylo-CpG jest znacznie niższe niż w przypadku znanych domen MBD ssaków.
Główna różnica wynika z braku dodatnio naładowanych reszt w AtMBD6, które przypuszczalnie oddziałują ze szkieletem DNA, jak widać w ssaczych kompleksach DNA MBD/metylo-CpG. Podsumowując, stworzyliśmy strukturalne podstawy rozpoznawania metylo-CpG przez AtMBD6, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób białka MBD działają jako mediatory sygnałów epigenetycznych w komórkach roślinnych.
- Czynniki transkrypcyjne (TF) to białka zaangażowane w regulację ekspresji genów. W epigenetyce ogólnie przyjmuje się, że metylowane nukleotydy mogą zapobiegać wiązaniu TF z fragmentami DNA. Jednak ostatnie badania potwierdziły, że niektóre TF mają zdolność do interakcji z metylowanymi fragmentami DNA w celu dalszej regulacji ekspresji genów.
- Chociaż eksperymenty biochemiczne mogą rozpoznać TF wiążące się z metylowanymi sekwencjami DNA, te mokre metody eksperymentalne są czasochłonne i kosztowne. Metody uczenia maszynowego stanowią dobry wybór do szybkiej identyfikacji tych TF bez użycia materiałów eksperymentalnych .
- W związku z tym badanie to ma na celu zaprojektowanie solidnego predyktora do wykrywania TF związanych z metylowanym DNA. Najpierw zaproponowaliśmy użycie funkcji wektora słowa tripeptydowego do formułowania próbek białka. Następnie, w oparciu o sieć neuronową rekurencyjną z długotrwałą pamięcią krótkotrwałą, zaprojektowano dwuetapowy model obliczeniowy. Predyktor pierwszego kroku został wykorzystany do odróżnienia czynników transkrypcyjnych od czynników nietranskrypcyjnych.
- Gdy białka zostały określone jako TF, zastosowano predyktor drugiego etapu, aby ocenić, czy TF mogą wiązać się z metylowanym DNA . W niezależnym teście zbioru danych dokładność pierwszego i drugiego kroku wynosi odpowiednio 86,63% i 73,59%. Ponadto analiza statystyczna dystrybucji tripeptydów w próbkach treningowych wykazała, że pozycja i liczba niektórych tripeptydów w sekwencji może wpływać na wiązanie TF z metylowanym DNA.
- Ostatecznie w oparciu o nasz model powstał darmowy serwer WWW oparty na proponowanym modelu, który jest dostępny pod adresem https://bioinfor.nefu.edu.cn/TFPM/
Metylowane DNA jest nie tylko biomarkerem diagnostycznym, ale także prognostycznym dla wczesnego stadium raka.
Jednak sekwencjonowanie wodorosiarczynem sodu jako „złoty standard” metody wykrywania markerów metylacji ma pewne wady, takie jak czasochłonność i pracochłonność procedur. Dlatego do analizy sekwencji DNA z resztami metylowanymi lub bez nich wymagane są proste i niezawodne metody.
Proponujemy tutaj prostą i bezpośrednią metodę wykrywania metylacji DNA poprzez jego przejście konformacyjne do G-kwadrupleksu przy użyciu tranzystora polowego bramkowanego roztworem (SG-FET) bez użycia materiałów znakowanych. Gen BCL-2 , który bierze udział w rozwoju różnych guzów ludzkich, zawiera segmenty G-bogate i ulega zmianie konformacyjnej do G-kwadrupleksu w zależności od stężenia K + .
Skumulowane nici G-kwadrupleksów poruszają się blisko powierzchni czujnika SG-FET, co skutkuje dużymi sygnałami elektrycznymi opartymi na wewnętrznych ładunkach molekularnych. Ponadto gęstą hydrofilową szczoteczkę polimerową zaszczepia się za pomocą inicjowanej powierzchniowo polimeryzacji rodnikowej z przeniesieniem atomu na powierzchnię czujnika SG-FET w celu zmniejszenia szumu elektrycznego w oparciu o niespecyficzną adsorpcję substancji zakłócających.
W szczególności kontrola grubości szczotki polimerowej indukuje sygnały elektryczne w oparciu o ładunki molekularne DNA w warstwie dyfuzyjnej, zgodnie z limitem długości Debye’a. Platforma oparta na czujniku SG-FET z dobrze zdefiniowaną szczoteczką polimerową jest odpowiednia do monitorowania in situ metylowanego DNA i stanowi urządzenie przyłóżkowe o wysokim stosunku sygnału do szumu i bez konieczności stosowania dodatkowych procesów takie jak konwersja wodorosiarczynu i reakcja łańcuchowa polimerazy.
Kilka leków przeciwnowotworowych opiera swoją cytotoksyczność na ich zdolności do interkalowania między parami zasad DNA.
Niemniej jednak ustalono, że mechanizm interkalacji leków w DNA rozpoczyna się od wcześniejszego sposobu interakcji leku z DNA wiązania rowka. Czasami, dla pewnego rodzaju płaskich małych cząsteczek, wiązanie przez rowki nie daje żadnego efektu cytotoksycznego i pożądane jest szybkie przejście takich płaskich małych cząsteczek do trybu interkalacji cytotoksycznej. Tak jest w przypadku metylowanych pochodnych fenantroliny (fen), gdzie zmiany w podstawieniu w pozycji i liczbie grup metylowych decydują o ich zdolności jako związków cytotoksycznych, a zatem jest to sposób na modulację efektów cytotoksycznych.
W tej pracy zbadaliśmy tę modulację za pomocą interakcji kompleksu [Pt(en)(phen)] 2+ i kilku pochodnych przez metylację fenu w różnej liczbie i pozycji oraz heksameru DNA d(GTCGAC) 2 przez rowek wiązanie przy użyciu metod PM6-DH2 i DFT-D. Analizę geometrii, struktury elektronowej i energetyki badanych układów porównano z pracami eksperymentalnymi, aby uzyskać wgląd w związek struktura-oddziaływanie dla badanych układów z cytotoksycznością.Trendy są wyjaśnione za pomocą wskaźnika interakcji niekowalencyjnych (NCI), analizy rozkładu energii (EDA) i wkładów solwatacyjnych. Nasze wyniki są zgodne z doświadczeniami, w których metylacja pozycji 4 fenu wydaje się faworyzować interakcję poprzez wiązanie rowka, co utrudnia przejście do interkalacyjnego trybu cytotoksycznego.
MethylFlash Methylated DNA Quantification Kit (Fluorometric) |
|||
| P-1035 | EpiGentek | 96 Assays | 904.05 EUR |
MethylFlash Methylated DNA 5-mC Quantification Kit (Colorimetric) |
|||
| P-1034 | EpiGentek | 96 Assays | 875.05 EUR |
Human Methylated DNA Control |
|||
| D6255815 | Biochain | 5 ug | 156 EUR |
Mouse Methylated DNA Control |
|||
| D6334149 | Biochain | 5 ug | Ask for price |
Rat Methylated DNA Control |
|||
| D6434149 | Biochain | 5 ug | Ask for price |
MethylFlash Hydroxymethylated DNA Quantification Kit (Fluorometric) |
|||
| P-1037 | EpiGentek | 96 Assays | 947.55 EUR |
Methylamp Universal Methylated DNA Kit |
|||
| P-1011 | EpiGentek | 20 Modifications | 570.55 EUR |
SuperSense Methylated DNA Quantification Kit |
|||
| P-1021 | EpiGentek | 96 Assays | 947.55 EUR |
EpiQuik Methylated DNA Immunoprecipitation Kit |
|||
| P-2019 | EpiGentek | 48 Reactions | 889.55 EUR |
Monkey (Rhesus) Methylated DNA Control |
|||
| D6534149 | Biochain | 5 ug | Ask for price |
Monkey (Cynomolgus) Methylated DNA Control |
|||
| D6534149-Cy | Biochain | 5 ug | Ask for price |
Methylated & Low-Methylated DNA Matching Pair - Human Peripheral Blood Leukocyte |
|||
| D6234148-PP | Biochain | 2x5 ug | 343 EUR |
Methylated & Low-Methylated DNA Matching Pair - Human Lymphocyte cell line |
|||
| D6254874-PP | Biochain | 2x5 ug | 343 EUR |
MethylFlash Hydroxymethylated DNA 5-hmC Quantification Kit (Colorimetric) |
|||
| P-1036 | EpiGentek | 96 Assays | 904.05 EUR |
Methylamp Methylated DNA Capture (MeDIP) Kit |
|||
| P-1015 | EpiGentek | 48 Reactions | 875.05 EUR |
Methylamp Universal Methylated DNA Preparation Kit |
|||
| P-1019 | EpiGentek | 40 µg | 347.25 EUR |
EpiQuik Tissue Methylated DNA Immunoprecipitation Kit |
|||
| P-2020 | EpiGentek | 48 Reactions | 889.55 EUR |
Fully CpG Methylated Human Genomic DNA |
|||
| X10000 | EpiGentek | 10 µg/100 µl | Ask for price |
Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase Antibody |
|||
| 20-abx109997 | Abbexa |
|
|
MethylFlash 5-Formylcytosine (5-fC) DNA Quantification Kit (Colorimetric) |
|||
| P-1041 | EpiGentek | 96 Assays | 947.55 EUR |
100 BP DNA LADDER, 500UL PER KIT |
|||
| M-DNA-100BP | CORNING | 1/pk | 73 EUR |
1 KB DNA LADDER, 500UL PER KIT |
|||
| M-DNA-1KB | CORNING | 1/pk | 70 EUR |
Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase Polyclonal Antibody |
|||
| 42551-100ul | SAB | 100ul | 333 EUR |
MethylFlash Global DNA Methylation (5-mC) ELISA Easy Kit (Colorimetric) |
|||
| P-1030 | EpiGentek | 96 reactions | 860.55 EUR |
MethylFlash Global DNA Hydroxymethylation (5-hmC) ELISA Easy Kit (Colorimetric) |
|||
| P-1032 | EpiGentek | 96 reactions | 889.55 EUR |
Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase Polyclonal Conjugated Antibody |
|||
| C42551 | SAB | 100ul | 397 EUR |
Dog MGMT/ Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase ELISA Kit |
|||
| E0070Do | Sunlong | 1 Kit | 717 EUR |
Human MGMT/ Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase ELISA Kit |
|||
| E1588Hu | Sunlong | 1 Kit | 571 EUR |
ELISA kit for Human Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase |
|||
| EK4201 | SAB | 96 tests | 553 EUR |
ELISA kit for Dog Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase |
|||
| EK4202 | SAB | 96 tests | 721 EUR |
Human MGMT(Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase) ELISA Kit |
|||
| EH2056 | FN Test | 96T | 567.6 EUR |
ELISA kit for Human Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase (MGMT) |
|||
| KTE62232-48T | Abbkine | 48T | 332 EUR |
ELISA kit for Human Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase (MGMT) |
|||
| KTE62232-5platesof96wells | Abbkine | 5 plates of 96 wells | 2115 EUR |
ELISA kit for Human Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase (MGMT) |
|||
| KTE62232-96T | Abbkine | 96T | 539 EUR |
Methylated Lysine Antibody |
|||
| abx448445-100ug | Abbexa | 100 ug | 537 EUR |
Pan Methylated Lysine |
|||
| DF7728 | Affbiotech | 200ul | 304 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-158D | Stressmarq | 0.1mg | 362 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-158D-A390 | Stressmarq | 0.1mg | 409 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-158D-A488 | Stressmarq | 0.1mg | 408 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-158D-A565 | Stressmarq | 0.1mg | 408 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-158D-A594 | Stressmarq | 0.1mg | 408 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-158D-A633 | Stressmarq | 0.1mg | 408 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-158D-A655 | Stressmarq | 0.1mg | 408 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-158D-A680 | Stressmarq | 0.1mg | 408 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-158D-A700 | Stressmarq | 0.1mg | 408 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-158D-ALP | Stressmarq | 0.1mg | 403 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-158D-APC | Stressmarq | 0.1mg | 408 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-158D-APCCY7 | Stressmarq | 0.1mg | 480 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-158D-DY350 | Stressmarq | 0.1mg | 423 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-158D-DY405 | Stressmarq | 0.1mg | 411 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-158D-DY488 | Stressmarq | 0.1mg | 402 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-158D-DY594 | Stressmarq | 0.1mg | 404 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-158D-DY633 | Stressmarq | 0.1mg | 399 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-158D-FITC | Stressmarq | 0.1mg | 401 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-158D-P594 | Stressmarq | 0.1mg | 415 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-158D-PCP | Stressmarq | 0.1mg | 408 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-158D-RPE | Stressmarq | 0.1mg | 406 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-158D-STR | Stressmarq | 0.1mg | 407 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-158S | Stressmarq | 0.012mg | 65 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-159F | Stressmarq | 0.4ml | 403 EUR |
Antibody for Methylated Lysine |
|||
| SPC-160F | Stressmarq | 0.4ml | 418 EUR |
Pan Methylated Lysine Antibody |
|||
| 20-abx159635 | Abbexa |
|
|
Pan Methylated Lysine Antibody |
|||
| abx217631-100ug | Abbexa | 100 ug | 439 EUR |
Methylated Lysine Antibody (APC) |
|||
| abx448362-100ug | Abbexa | 100 ug | 592 EUR |
Methylated Lysine Antibody (FITC) |
|||
| abx448376-100ug | Abbexa | 100 ug | 578 EUR |
Methylated Lysine Antibody (PerCP) |
|||
| abx448396-100ug | Abbexa | 100 ug | 592 EUR |
Methylated Lysine Antibody (RPE) |
|||
| abx448404-100ug | Abbexa | 100 ug | 592 EUR |
Methylated Lysine Antibody (Streptavidin) |
|||
| abx448412-100ug | Abbexa | 100 ug | 592 EUR |
Methylated Lysine Antibody (Biotin) |
|||
| abx448446-400ul | Abbexa | 400 ul | 578 EUR |
Methylated Lysine Antibody (HRP) |
|||
| abx448447-400ul | Abbexa | 400 ul | 606 EUR |
Human cDNA FLJ56323, highly similar to Methylated-DNA--protein-cysteinemethyltransferase (EC 2.1.1.63) |
|||
| 1-CSB-RP118594h | Cusabio |
|
|
MethylFlash Urine N6-methyladenosine (m6A) Quantification Kit (Colorimetric) |
|||
| P-9015 | EpiGentek | 96 Assays | 788.05 EUR |
Pan Methylated Lysine Monoclonal Antibody |
|||
| EM1186-100ul | ELK Biotech | 100ul | 279 EUR |
Pan Methylated Lysine Monoclonal Antibody |
|||
| EM1186-50ul | ELK Biotech | 50ul | 207 EUR |
Methylated Lysine Antibody (ATTO 390) |
|||
| abx448290-100ug | Abbexa | 100 ug | 592 EUR |
Methylated Lysine Antibody (ATTO 488) |
|||
| abx448298-100ug | Abbexa | 100 ug | 592 EUR |
Methylated Lysine Antibody (ATTO 565) |
|||
| abx448306-100ug | Abbexa | 100 ug | 592 EUR |
Methylated Lysine Antibody (ATTO 594) |
|||
| abx448314-100ug | Abbexa | 100 ug | 592 EUR |
Methylated Lysine Antibody (ATTO 633) |
|||
| abx448322-100ug | Abbexa | 100 ug | 592 EUR |
Methylated Lysine Antibody (ATTO 655) |
|||
| abx448330-100ug | Abbexa | 100 ug | 592 EUR |
Methylated Lysine Antibody (ATTO 680) |
|||
| abx448338-100ug | Abbexa | 100 ug | 592 EUR |
Methylated Lysine Antibody (ATTO 700) |
|||
| abx448346-100ug | Abbexa | 100 ug | 592 EUR |
Methylated Lysine Antibody (Alkaline Phosphatase) |
|||
| abx448354-100ug | Abbexa | 100 ug | 578 EUR |
Anti-Pan Methylated Lysine antibody |
|||
| STJ97446 | St John's Laboratory | 200 µl | 197 EUR |
Pan Methylated Lysine Monoclonal Antibody |
|||
| HW099-100ul | SAB | 100ul | 252 EUR |
Pan Methylated Lysine Monoclonal Antibody |
|||
| HW099-50ul | SAB | 50ul | 187 EUR |
Pan Methylated Lysine Rabbit pAb |
|||
| ABD7728 | Lifescience Market | 100 ug | 438 EUR |
Pan Methylated Lysine Blocking Peptide |
|||
| DF7728-BP | Affbiotech | 1mg | 195 EUR |
MethylFlash Urine 5-Methylcytosine (5-mC) Quantification Kit (Colorimetric) |
|||
| P-1039 | EpiGentek | 96 Assays | 788.05 EUR |
MethylFlash Urine 5-Methylcytosine (5-mC) Quantification Kit (Fluorometric) |
|||
| P-1040 | EpiGentek | 96 Assays | 788.05 EUR |
MethylFlash 5-mC RNA Methylation ELISA Easy Kit (Fluorometric) |
|||
| P-9009 | EpiGentek | 48 reactions | 496.6 EUR |
Pan Methylated Lysine Monoclonal Antibody (Mix) |
|||
| ABM40195-003ml | Abbkine | 0.03ml | 158 EUR |
Pan Methylated Lysine Monoclonal Antibody (Mix) |
|||
| ABM40195-01ml | Abbkine | 0.1ml | 289 EUR |
Pan Methylated Lysine Monoclonal Antibody (Mix) |
|||
| ABM40195-02ml | Abbkine | 0.2ml | 414 EUR |
Methylated Lysine Antibody (PE / ATTO 594) |
|||
| abx448388-100ug | Abbexa | 100 ug | 606 EUR |
HUMAN histone H3control ( H3 - methylated) peptide |
|||
| AB-23119-P | Alpha Diagnostics | 100ug | 164 EUR |
Human Histone H3.3 control (methylated) peptide |
|||
| AB-23221-P | Alpha Diagnostics | 100ug | 164 EUR |
Human Histone H3.3 control (methylated) peptide |
|||
| AB-23222-P | Alpha Diagnostics | 100ug | 164 EUR |
HUMAN histone H3 control (non-methylated) peptide |
|||
| AB-23119-CP | Alpha Diagnostics | 100ug | 164 EUR |
HUMAN histone H3 control (non-methylated) peptide |
|||
| AB-23220-CP | Alpha Diagnostics | 100ug | 164 EUR |
Patrząc na wyniki NCI, oddziaływania te pochodzą nie tylko z oddziaływań CH/π i CH/n grupy metylowej w pozycji 4, ale także z ligandu etylenodiaminy (en), którego orientację w kompleksie Pt stwierdzono w ten sposób że wytwarza dużą liczbę słabych interakcji z DNA, zwłaszcza ze szkieletem cukrowym i fosforanowym