Ewa Agro Art Badania

Strukturalne wglądy w rozpoznawanie metylowanego DNA przez domenę wiążącą metyl-CpG MBD6 z Arabidopsis thaliana

• Ewa
• 9 czerwca, 202210 czerwca, 2022
• 0

Metylacja cytozyny jest modyfikacją epigenetyczną niezbędną do tworzenia dojrzałej heterochromatyny, wyciszania genów i stabilności genomu. W roślinach metylacja zachodzi nie tylko w obrębie zasad cytozyny w CpG, ale także w kontekstach CpHpG i CpHpH, gdzie H oznacza A, T lub C. Białka z domeną wiążącą metyl-CpG (MBD), które rozpoznają symetryczne dinukleotydy represory genów w komórkach ssaków są również obecne w komórkach roślinnych, chociaż ich właściwości strukturalne i funkcjonalne wciąż pozostają słabo poznane.

Aby wypełnić tę lukę, w tym badaniu określiliśmy strukturę roztworu domeny MBD białka MBD6 z  Arabidopsis thaliana  i zbadaliśmy jego właściwości wiązania z metylowanym DNA za pomocą testów wiązania i dogłębnej analizy spektroskopowej NMR. Domena AtMBD6 MBD fałduje się w kanoniczną strukturę MBD zgodnie ze swoistością wiązania z metylo-CpG i posiada interfejs wiązania DNA podobny do ssaczych domen MBD.

Co jednak intrygujące, stwierdzono, że powinowactwo wiązania domeny MBD AtMBD6 z DNA zawierającym metylo-CpG jest znacznie niższe niż w przypadku znanych domen MBD ssaków.

Główna różnica wynika z braku dodatnio naładowanych reszt w AtMBD6, które przypuszczalnie oddziałują ze szkieletem DNA, jak widać w ssaczych kompleksach DNA MBD/metylo-CpG. Podsumowując, stworzyliśmy strukturalne podstawy rozpoznawania metylo-CpG przez AtMBD6, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób białka MBD działają jako mediatory sygnałów epigenetycznych w komórkach roślinnych.

• Czynniki transkrypcyjne (TF) to białka zaangażowane w regulację ekspresji genów. W epigenetyce ogólnie przyjmuje się, że metylowane nukleotydy mogą zapobiegać wiązaniu TF z fragmentami DNA. Jednak ostatnie badania potwierdziły, że niektóre TF mają zdolność do interakcji z metylowanymi fragmentami DNA w celu dalszej regulacji ekspresji genów.
• Chociaż eksperymenty biochemiczne mogą rozpoznać TF wiążące się z metylowanymi sekwencjami DNA, te mokre metody eksperymentalne są czasochłonne i kosztowne. Metody uczenia maszynowego stanowią dobry wybór do szybkiej identyfikacji tych TF bez użycia materiałów eksperymentalnych .
• W związku z tym badanie to ma na celu zaprojektowanie solidnego predyktora do wykrywania TF związanych z metylowanym DNA. Najpierw zaproponowaliśmy użycie funkcji wektora słowa tripeptydowego do formułowania próbek białka. Następnie, w oparciu o sieć neuronową rekurencyjną z długotrwałą pamięcią krótkotrwałą, zaprojektowano dwuetapowy model obliczeniowy. Predyktor pierwszego kroku został wykorzystany do odróżnienia czynników transkrypcyjnych od czynników nietranskrypcyjnych.
• Gdy białka zostały określone jako TF, zastosowano predyktor drugiego etapu, aby ocenić, czy TF mogą wiązać się z metylowanym DNA . W niezależnym teście zbioru danych dokładność pierwszego i drugiego kroku wynosi odpowiednio 86,63% i 73,59%. Ponadto analiza statystyczna dystrybucji tripeptydów w próbkach treningowych wykazała, że ​​pozycja i liczba niektórych tripeptydów w sekwencji może wpływać na wiązanie TF z metylowanym DNA.
• Ostatecznie w oparciu o nasz model powstał darmowy serwer WWW oparty na proponowanym modelu, który jest dostępny pod adresem https://bioinfor.nefu.edu.cn/TFPM/

Metylowane DNA jest nie tylko biomarkerem diagnostycznym, ale także prognostycznym dla wczesnego stadium raka.

Jednak sekwencjonowanie wodorosiarczynem sodu jako „złoty standard” metody wykrywania markerów metylacji ma pewne wady, takie jak czasochłonność i pracochłonność procedur. Dlatego do analizy sekwencji DNA z resztami metylowanymi lub bez nich wymagane są proste i niezawodne metody.

Proponujemy tutaj prostą i bezpośrednią metodę wykrywania metylacji DNA poprzez jego przejście konformacyjne do G-kwadrupleksu przy użyciu tranzystora polowego bramkowanego roztworem (SG-FET) bez użycia materiałów znakowanych. Gen  BCL-2  , który bierze udział w rozwoju różnych guzów ludzkich, zawiera segmenty G-bogate i ulega zmianie konformacyjnej do G-kwadrupleksu w zależności od  stężenia K ^{+ .}

 

Skumulowane nici G-kwadrupleksów poruszają się blisko powierzchni czujnika SG-FET, co skutkuje dużymi sygnałami elektrycznymi opartymi na wewnętrznych ładunkach molekularnych. Ponadto gęstą hydrofilową szczoteczkę polimerową zaszczepia się za pomocą inicjowanej powierzchniowo polimeryzacji rodnikowej z przeniesieniem atomu na powierzchnię czujnika SG-FET w celu zmniejszenia szumu elektrycznego w oparciu o niespecyficzną adsorpcję substancji zakłócających.

W szczególności kontrola grubości szczotki polimerowej indukuje sygnały elektryczne w oparciu o ładunki molekularne DNA w warstwie dyfuzyjnej, zgodnie z limitem długości Debye’a. Platforma oparta na czujniku SG-FET z dobrze zdefiniowaną szczoteczką polimerową jest odpowiednia do  monitorowania in situ  metylowanego DNA i stanowi urządzenie przyłóżkowe o wysokim stosunku sygnału do szumu i bez konieczności stosowania dodatkowych procesów takie jak konwersja wodorosiarczynu i reakcja łańcuchowa polimerazy.

Kilka leków przeciwnowotworowych opiera swoją cytotoksyczność na ich zdolności do interkalowania między parami zasad DNA.

Niemniej jednak ustalono, że mechanizm interkalacji leków w DNA rozpoczyna się od wcześniejszego sposobu interakcji leku z DNA wiązania rowka. Czasami, dla pewnego rodzaju płaskich małych cząsteczek, wiązanie przez rowki nie daje żadnego efektu cytotoksycznego i pożądane jest szybkie przejście takich płaskich małych cząsteczek do trybu interkalacji cytotoksycznej. Tak jest w przypadku metylowanych pochodnych fenantroliny (fen), gdzie zmiany w podstawieniu w pozycji i liczbie grup metylowych decydują o ich zdolności jako związków cytotoksycznych, a zatem jest to sposób na modulację efektów cytotoksycznych.

W tej pracy zbadaliśmy tę modulację za pomocą interakcji kompleksu [Pt(en)(phen)] ²⁺  i kilku pochodnych przez metylację fenu w różnej liczbie i pozycji oraz  heksameru DNA  d(GTCGAC) ₂ przez  rowek wiązanie przy użyciu metod PM6-DH2 i DFT-D. Analizę geometrii, struktury elektronowej i energetyki badanych układów porównano z pracami eksperymentalnymi, aby uzyskać wgląd w związek struktura-oddziaływanie dla badanych układów z cytotoksycznością.Trendy są wyjaśnione za pomocą wskaźnika interakcji niekowalencyjnych (NCI), analizy rozkładu energii (EDA) i wkładów solwatacyjnych. Nasze wyniki są zgodne z doświadczeniami, w których metylacja pozycji 4 fenu wydaje się faworyzować interakcję  poprzez  wiązanie rowka, co utrudnia przejście do interkalacyjnego trybu cytotoksycznego.

MethylFlash Methylated DNA Quantification Kit (Fluorometric)
P-1035	EpiGentek	1084.86 EUR 424.60 EUR 738.10 EUR	96 Assays 48 Assays 96 Assays
MethylFlash Methylated DNA 5-mC Quantification Kit (Colorimetric)
P-1034	EpiGentek	1050.06 EUR 387.20 EUR 712.80 EUR	96 Assays 48 Assays 96 Assays
MethylFlash Hydroxymethylated DNA Quantification Kit (Fluorometric)
P-1037	EpiGentek	1137.06 EUR 463.10 EUR 775.50 EUR	96 Assays 48 Assays 96 Assays
MethylFlash 5-Formylcytosine (5-fC) DNA Quantification Kit (Colorimetric)
P-1041	EpiGentek	1137.06 EUR 442.20 EUR 760.10 EUR	96 Assays 48 Assays 96 Assays
SuperSense Methylated DNA Quantification Kit
P-1021	EpiGentek	1137.06 EUR 442.20 EUR 760.10 EUR	96 Assays 48 Assays 96 Assays
MethylFlash Hydroxymethylated DNA 5-hmC Quantification Kit (Colorimetric)
P-1036	EpiGentek	1084.86 EUR 424.60 EUR 738.10 EUR	96 Assays 48 Assays 96 Assays
MethylFlash Urine 5-Methylcytosine (5-mC) Quantification Kit (Colorimetric)
P-1039	EpiGentek	945.66 EUR 360.80 EUR 625.90 EUR	96 Assays 48 Assays 96 Assays
MethylFlash Urine 5-Methylcytosine (5-mC) Quantification Kit (Fluorometric)
P-1040	EpiGentek	945.66 EUR 360.80 EUR 625.90 EUR	96 Assays 48 Assays 96 Assays
MethylFlash Urine N6-methyladenosine (m6A) Quantification Kit (Colorimetric)
P-9015	EpiGentek	945.66 EUR 380.60 EUR 625.90 EUR	96 Assays 48 Assays 96 Assays
Methylamp Global DNA Methylation Quantification Ultra Kit
P-1014B	EpiGentek	1137.06 EUR 429.00 EUR 760.10 EUR	96 Assays 48 Assays 96 Assays
MethylFlash Global DNA Methylation (5-mC) ELISA Easy Kit (Colorimetric)
P-1030	EpiGentek	1032.66 EUR 371.80 EUR 673.20 EUR	96 reactions 48 reactions 96 reactions
EpiQuik m6A RNA Methylation Quantification Kit (Colorimetric)
P-9005	EpiGentek	945.66 EUR 387.20 EUR 639.10 EUR	96 Reactions 48 Assays 96 Assays
EpiQuik m6A RNA Methylation Quantification Kit (Fluorometric)
P-9008	EpiGentek	945.66 EUR 387.20 EUR 639.10 EUR	96 Assays 48 Assays 96 Assays
MethylFlash 5-mC RNA Methylation ELISA Easy Kit (Fluorometric)
P-9009	EpiGentek	595.92 EUR 387.20 EUR 639.10 EUR	48 reactions 48 reactions 96 reactions
Rat Methylated DNA Control
D6434149	Biochain	5 ug	Ask for price
Methylamp Universal Methylated DNA Kit
P-1011	EpiGentek	684.66 EUR 292.60 EUR 442.20 EUR	20 Modifications 10 Modifications 20 Modifications
Human Methylated DNA Control
D6255815	Biochain	5 ug	128 EUR
Mouse Methylated DNA Control
D6334149	Biochain	5 ug	Ask for price
Methylamp Methylated DNA Capture (MeDIP) Kit
P-1015	EpiGentek	1050.06 EUR 424.60 EUR 712.80 EUR	48 Reactions 24 Reactions 48 Reactions
MethylFlash Global DNA Hydroxymethylation (5-hmC) ELISA Easy Kit (Colorimetric)
P-1032	EpiGentek	1067.46 EUR 396.00 EUR 696.30 EUR	96 reactions 48 reactions 96 reactions
Monkey (Rhesus) Methylated DNA Control
D6534149	Biochain	5 ug	Ask for price
Methylamp Universal Methylated DNA Preparation Kit
P-1019	EpiGentek	40 µg	416.7 EUR
Monkey (Cynomolgus) Methylated DNA Control
D6534149-Cy	Biochain	5 ug	Ask for price
EpiQuik Methylated DNA Immunoprecipitation Kit
P-2019	EpiGentek	1067.46 EUR 451.00 EUR 724.90 EUR	48 Reactions 24 Reactions 48 Reactions
Fully CpG Methylated Human Genomic DNA
X10000	EpiGentek	10 µg/100 µl	Ask for price
DNA Damage Quantification Kit
55R-1345	Fitzgerald	25 assays	1012.8 EUR
EpiQuik Tissue Methylated DNA Immunoprecipitation Kit
P-2020	EpiGentek	1067.46 EUR 442.20 EUR 710.60 EUR	48 Reactions 24 Reactions 48 Reactions
FitAmp General DNA Quantification Kit
P-1020	EpiGentek	361.02 EUR 126.50 EUR 213.40 EUR	96 Assays 48 Assays 96 Assays
Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase Antibody
20-abx109997	Abbexa	493.20 EUR 2214.00 EUR 718.80 EUR 218.40 EUR 360.00 EUR	100 ug 1 mg 200 ug 20 ug 50 ug
DNA Quantification Assay Kit (Fluorometric)
K539-200	Biovision	each	314.4 EUR
DNA Quantification Assay Kit (Fluorometric)
K539-2000	Biovision	each	470.4 EUR
FitAmp Circulating DNA Quantification Kit
P-1012	EpiGentek	595.92 EUR 217.80 EUR 387.20 EUR	96 Assays 48 Assays 96 Assays
Broad Range DNA Quantification Kit, 100 assays
NS1020-BR-100	Benchmark Scientific	1 each	131.3 EUR
Methylated & Low-Methylated DNA Matched Pair - Human Lymphocyte cell line
D6254874-PP	Biochain	2x5 ug	351 EUR
DNA Damage Quantification Colorimetric Kit
K253-25	Biovision	each	732 EUR
DNA Damage Quantification Colorimetric Kit
K2100-25	ApexBio	25 assays	752.4 EUR
Library Quantification DNA Standards (S1-S6)
20-abx098897	Abbexa	744.00 EUR 744.00 EUR 744.00 EUR 744.00 EUR	25%, 120 ul 37.5%, 120 ul 50%, 120 ul 62.5%, 120 ul
High Sensitivity DNA Quantification Kit, 100 assays
NS1020-HS-100	Benchmark Scientific	1 each	131.3 EUR
Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase Polyclonal Antibody
42551-100ul	SAB	100ul	399.6 EUR
Methylated Lysine Antibody
abx448445-100ug	Abbexa	100 ug	644.4 EUR
Methylated & Low-Methylated DNA Matched Pair - Human Peripheral Blood Leukocyte
D6234148-PP	Biochain	2x5 ug	351 EUR
ELISA kit for Dog Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase
EK4202	SAB	96 tests	865.2 EUR
Dog MGMT/ Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase ELISA Kit
E0070Do	Sunlong	1 Kit	860.4 EUR
ELISA kit for Human Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase
EK4201	SAB	96 tests	663.6 EUR
Human MGMT(Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase) ELISA Kit
EH2056	FN Test	96T	681.12 EUR
Human MGMT/ Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase ELISA Kit
E1588Hu	Sunlong	1 Kit	685.2 EUR
Pan Methylated Lysine Antibody
abx217631-100ug	Abbexa	100 ug	526.8 EUR
Methylated Lysine Antibody (APC)
abx448362-100ug	Abbexa	100 ug	710.4 EUR
Methylated Lysine Antibody (RPE)
abx448404-100ug	Abbexa	100 ug	710.4 EUR
Methylated Lysine Antibody (HRP)
abx448447-400ul	Abbexa	400 ul	727.2 EUR
Pan Methylated Lysine Antibody
DF7728	Affbiotech	200ul	420 EUR
Pan Methylated Lysine Antibody
20-abx159635	Abbexa	326.40 EUR 276.00 EUR	100 ug 50 ug
Antibody for Methylated Lysine
SPC-158D	Stressmarq	0.1mg	434.4 EUR
Antibody for Methylated Lysine
SPC-158D-A390	Stressmarq	0.1mg	490.8 EUR
Antibody for Methylated Lysine
SPC-158D-A488	Stressmarq	0.1mg	489.6 EUR
Antibody for Methylated Lysine
SPC-158D-A565	Stressmarq	0.1mg	489.6 EUR
Antibody for Methylated Lysine
SPC-158D-A594	Stressmarq	0.1mg	489.6 EUR
Antibody for Methylated Lysine
SPC-158D-A633	Stressmarq	0.1mg	489.6 EUR
Antibody for Methylated Lysine
SPC-158D-A655	Stressmarq	0.1mg	489.6 EUR
Antibody for Methylated Lysine
SPC-158D-A680	Stressmarq	0.1mg	489.6 EUR
Antibody for Methylated Lysine
SPC-158D-A700	Stressmarq	0.1mg	489.6 EUR
Antibody for Methylated Lysine
SPC-158D-ALP	Stressmarq	0.1mg	483.6 EUR
Antibody for Methylated Lysine
SPC-158D-APC	Stressmarq	0.1mg	489.6 EUR
Antibody for Methylated Lysine
SPC-158D-APCCY7	Stressmarq	0.1mg	576 EUR
Antibody for Methylated Lysine
SPC-158D-DY350	Stressmarq	0.1mg	507.6 EUR
Antibody for Methylated Lysine
SPC-158D-DY405	Stressmarq	0.1mg	493.2 EUR
Antibody for Methylated Lysine
SPC-158D-DY488	Stressmarq	0.1mg	482.4 EUR
Antibody for Methylated Lysine
SPC-158D-DY594	Stressmarq	0.1mg	484.8 EUR
Antibody for Methylated Lysine
SPC-158D-DY633	Stressmarq	0.1mg	478.8 EUR
Antibody for Methylated Lysine
SPC-158D-FITC	Stressmarq	0.1mg	481.2 EUR
Antibody for Methylated Lysine
SPC-158D-P594	Stressmarq	0.1mg	498 EUR
Antibody for Methylated Lysine
SPC-158D-PCP	Stressmarq	0.1mg	489.6 EUR
Antibody for Methylated Lysine
SPC-158D-RPE	Stressmarq	0.1mg	487.2 EUR
Antibody for Methylated Lysine
SPC-158D-STR	Stressmarq	0.1mg	488.4 EUR
Antibody for Methylated Lysine
SPC-158S	Stressmarq	0.012mg	78 EUR
Antibody for Methylated Lysine
SPC-159F	Stressmarq	0.4ml	483.6 EUR
Antibody for Methylated Lysine
SPC-160F	Stressmarq	0.4ml	501.6 EUR
Methylated Lysine Antibody (FITC)
abx448376-100ug	Abbexa	100 ug	693.6 EUR
Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase Polyclonal Conjugated Antibody
C42551	SAB	100ul	476.4 EUR
Methylated Lysine Antibody (PerCP)
abx448396-100ug	Abbexa	100 ug	710.4 EUR
ELISA kit for Human Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase (MGMT)
KTE62232-48T	Abbkine	48T	398.4 EUR
ELISA kit for Human Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase (MGMT)
KTE62232-5platesof96wells	Abbkine	5 plates of 96 wells	2538 EUR
ELISA kit for Human Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase (MGMT)
KTE62232-96T	Abbkine	96T	646.8 EUR
Pan Methylated Lysine Rabbit pAb
ABD7728	Lifescience Market	100 ug	525.6 EUR
Methylated Lysine Antibody (Biotin)
abx448446-400ul	Abbexa	400 ul	693.6 EUR
Mutation Quantification Control Plasma with 50 ng spike in DNA
Z2010003	Biochain	5 ml	162 EUR
Mutation Quantification Control Plasma with 250 ng spike in DNA
Z2010004	Biochain	25 ml	540 EUR
VAHTS Library Quantification Kit for IIIumina (DNA Standards)
NQ105	Vazyme	8 rxn	432 EUR
Methylated Lysine Antibody (ATTO 390)
abx448290-100ug	Abbexa	100 ug	710.4 EUR
Methylated Lysine Antibody (ATTO 488)
abx448298-100ug	Abbexa	100 ug	710.4 EUR
Methylated Lysine Antibody (ATTO 565)
abx448306-100ug	Abbexa	100 ug	710.4 EUR
Methylated Lysine Antibody (ATTO 594)
abx448314-100ug	Abbexa	100 ug	710.4 EUR
Methylated Lysine Antibody (ATTO 633)
abx448322-100ug	Abbexa	100 ug	710.4 EUR
Methylated Lysine Antibody (ATTO 655)
abx448330-100ug	Abbexa	100 ug	710.4 EUR
Methylated Lysine Antibody (ATTO 680)
abx448338-100ug	Abbexa	100 ug	710.4 EUR
Methylated Lysine Antibody (ATTO 700)
abx448346-100ug	Abbexa	100 ug	710.4 EUR
Anti-Pan Methylated Lysine antibody
STJ97446	St John's Laboratory	200 µl	236.4 EUR
Methylated Lysine Antibody (PE / ATTO 594)
abx448388-100ug	Abbexa	100 ug	727.2 EUR
Pan Methylated Lysine Blocking Peptide
DF7728-BP	Affbiotech	1mg	234 EUR
Methylated Lysine Antibody (Streptavidin)
abx448412-100ug	Abbexa	100 ug	710.4 EUR

Patrząc na wyniki NCI, oddziaływania te pochodzą nie tylko z oddziaływań CH/π i CH/n grupy metylowej w pozycji 4, ale także z ligandu etylenodiaminy (en), którego orientację w kompleksie Pt stwierdzono w ten sposób że wytwarza dużą liczbę słabych interakcji z DNA, zwłaszcza ze szkieletem cukrowym i fosforanowym